2019年12月18日，密切圍繞"國(guó)家藥品安全十三五規(guī)劃"的總體目標(biāo)，以建立"最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)"為準(zhǔn)則，對(duì)標(biāo)國(guó)際先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)家藥典委員會(huì)官網(wǎng)發(fā)布2322《汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法》（第三次征求意見稿），公示期為一個(gè)月，對(duì)中藥行業(yè)具有深遠(yuǎn)的意義，由于中藥成分的復(fù)雜性，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)難以全面評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量并發(fā)現(xiàn)潛在的質(zhì)量問題，本文為大家梳理了汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法相關(guān)知識(shí)點(diǎn)。

       一、中藥材汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法現(xiàn)狀

       在中藥材重金屬及有害元素殘留控制方面，目前大多數(shù)國(guó)家藥典主要制定了汞、砷等殘留標(biāo)準(zhǔn)，2015版《中國(guó)藥典》在技術(shù)上實(shí)現(xiàn)了多種重金屬有害元素同時(shí)檢測(cè)，還首次針對(duì)重金屬在不同價(jià)態(tài)表現(xiàn)出不同的藥理和**作用的特點(diǎn)，探索制定了汞和砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法，可以說在重金屬及有害元素檢測(cè)水平上開始借鑒國(guó)際先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)和科學(xué)理念，更加注重與國(guó)際藥品通用性技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一協(xié)調(diào)。

       二、三版本《汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法》對(duì)照看

       按照《中國(guó)藥典》2020年版編制工作進(jìn)度安排，2322《汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法》第一、二、三次征求意見稿已分別于2018年11月、2019年5月、2019年12月在國(guó)家藥典委員會(huì)官網(wǎng)面向社會(huì)各界公開征求意見，針對(duì)重金屬在不同價(jià)態(tài)表現(xiàn)出不同的藥理和**作用的特點(diǎn)，逐漸修訂完善了汞和砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法，可以說在重金屬及有害元素檢測(cè)水平上，經(jīng)過修訂和完善，我國(guó)2020年版藥典可達(dá)到國(guó)際先進(jìn)的水平。

       紅色字體標(biāo)注的為第一次征求意見稿修訂內(nèi)容。

       淡橙色底紋標(biāo)注的為第二次征求意見稿修訂內(nèi)容。

       淡藍(lán)色底紋標(biāo)注的為第三次征求意見稿修訂內(nèi)容。

       2322   汞和、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法

       本法系采用高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜法測(cè)定供試品中汞或、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)。

       由于元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)分析的前處理方法與樣品密切相關(guān)，供試品溶液的制備方法如有特殊要求應(yīng)在品種項(xiàng)下進(jìn)另行規(guī)定。

       一、汞元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法

       照高效液相色譜法-電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定法（通則0412）測(cè)定。

       色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（150mm×4.6mm，5µm）；以甲醇-0.01mol/L乙酸銨溶液（含0.12%L-半胱氨酸，氨水調(diào)節(jié)pH值至7.5）（8:92）為流動(dòng)相；流速為1.0ml/min。以具同軸霧化器和碰撞反應(yīng)池的電感耦合等離子體質(zhì)譜（具碰撞反應(yīng)池）進(jìn)行檢測(cè)；測(cè)定時(shí)選取同位素為²⁰²Hg，根據(jù)干擾情況選擇正常模式或碰撞池反應(yīng)模式。3種不同形態(tài)汞及不同價(jià)態(tài)汞的分離度應(yīng)大于1.5（圖1）。

       圖 1 汞元素形態(tài)及價(jià)態(tài)示意圖測(cè)定圖譜

       1.氯 化 汞（二價(jià)汞）；2.甲基汞；3.乙基汞

       對(duì)照品貯備溶液的制備 分別取氯 化 汞、甲基汞、乙基汞對(duì)照品適量，精密稱定，再精密吸取汞元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/ml，介質(zhì)類型為硝酸）適量，加 8％甲醇制成每1ml各含100ng（均以汞計(jì)）的溶液，即得。

       標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備 精密吸取對(duì)照品貯備液適量，加8％甲醇分別制成每1ml各含0.5ng、1ng、5ng、10ng、20ng（均以汞計(jì)）系列濃度的溶液，即得。

       供試品溶液的制備 （1）礦物藥及其制劑：除另有規(guī)定外，取供試品適量，取相當(dāng)于含汞量20～30mg的供試品粉末（過四號(hào)篩），精密稱定，精密加入人工胃液或人工腸液適量，置37℃水浴中超聲處理適當(dāng)時(shí)間，搖勻，取適量，靜置約2420～36小時(shí)，吸取中層溶液適量，用微孔濾膜（10μm）濾過，精密量取續(xù)濾液適量，用0.125mol/L鹽酸溶液稀釋至一定體積，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

       （2）動(dòng)、植物類中藥（除甲類、毛發(fā)類）：除另有規(guī)定外，取供試品粉末（過三號(hào)篩）0.2～0.5g，精密稱定，加0.1mol/L硝酸銀溶液200～600μl，精密加入硝酸人工胃液適量，置37～45℃水浴中加熱約20～24小時(shí)，取出，搖勻，室溫放置2小時(shí)，取上清液，用一次性雙層濾膜（10μm+3μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。同法制備空白溶液。

       測(cè)定法 分別吸取系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和供試品溶液各20～100μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。以系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中不同形態(tài)汞或不同價(jià)態(tài)汞的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算供試品溶液中不同形態(tài)或不同價(jià)態(tài)汞的含量，即得。

       二、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法

       照高效液相色譜法-電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定法（通則0412）測(cè)定。

       色譜、質(zhì)譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物載體鍵合三甲基銨陰離子交換材料或相當(dāng)?shù)牟牧蠟樘畛鋭?50×4.1mm；10µm）；以0.025mol/L磷酸二氫銨溶液（氨水調(diào)節(jié)pH值至8.0）為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0ml/min。以具同軸霧化器和碰撞反應(yīng)池的電感耦合等離子體質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)；測(cè)定時(shí)選取同位素為⁷⁵As，選擇碰撞池反應(yīng)模式或根據(jù)不同儀器的要求選用適宜校正方程進(jìn)行校正。

       6 種不同形態(tài)砷的分離度應(yīng)符合要求，其中砷膽堿、砷甜菜堿和亞砷酸的分離度應(yīng)不小于1.0（圖2）。

       圖 2 砷元素形態(tài)及價(jià)態(tài)示意圖測(cè)定圖譜

       1.砷膽堿；2.砷甜菜堿；3.亞砷酸（三價(jià)砷）

       4.二甲基砷；5.一甲基砷；6.砷酸（五價(jià)砷）

       對(duì)照品貯備溶液的制備 分別取亞砷酸、砷酸、一甲基砷、二甲基砷、砷膽堿、砷甜菜堿對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每 1ml各含 2.0μg（均以砷計(jì)）的對(duì)照品溶液，即得。

       標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備 精密吸取對(duì)照品貯備溶液適量，加0.02mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液制成每1ml各含1ng、5ng、20ng、50ng、100ng、200ng、500ng（均以砷計(jì)）系列濃度的溶液，搖勻，即得。

       供試品溶液的制備

       （1）礦物藥及其制劑：除另有規(guī)定外，取供試品適量，取相當(dāng)于含砷量20～30mg的供試品粉末（過四號(hào)篩），精密稱定，精密加入人工腸液適量，置37℃水浴中超聲處理適當(dāng)時(shí)間，搖勻，取適量，靜置約2420～36小時(shí)，吸取中層溶液適量，用微孔濾膜（10μm）濾過，精密量取續(xù)濾液適量，用0.02mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液稀釋至一定體積，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

       （2）動(dòng)、植物類中藥（除甲類、毛發(fā)類）：除另有規(guī)定外，取供試品粉末（過三號(hào)篩）0.2～0.5g，精密稱定，精密加入硝酸人工胃液適量，置37～45℃水浴中加熱約20～24小時(shí)，取出，搖勻，放置2小時(shí)，取上清液，用一次性雙層濾膜（10μm+3μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。同法制備空白溶液。

       測(cè)定法 分別吸取系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和供試品溶液各20～100μl，注入液相色譜儀，測(cè)定。以系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中不同形態(tài)砷或不同價(jià)態(tài)砷的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算供試品溶液中不同形態(tài)或不同價(jià)態(tài)砷的含量，即得。

       【附注】

       ①　所用玻璃儀器使用前均需以20%硝酸溶液（V/V）浸泡24小時(shí)或其他適宜方法進(jìn)行處理，避免干擾。

       ②　本法系汞和砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)的通用性測(cè)定方法，在滿足系統(tǒng)適用性的條件下，并非每次測(cè)定均需配制3種汞或6種砷的形態(tài)及其價(jià)態(tài)系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，可根據(jù)實(shí)際情況僅配制需要分析的汞或砷形態(tài)及其價(jià)態(tài)的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

       ③　進(jìn)行汞元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)分析時(shí)，由于色譜柱中暴露的未完全封端硅羥基對(duì)Hg²⁺的影響，導(dǎo)致色譜柱柱效損失較快。建議采用封端覆蓋率較高的色譜柱，且必要時(shí)，在一定進(jìn)樣間隔，以采用閥切換技術(shù)以高比例有機(jī)相沖洗色譜柱后再繼續(xù)分析。

       ④　硝酸人工胃液：取32.8ml稀硝酸，加水約800ml與人工胃蛋白酶10g，搖勻后，加水稀釋成1000ml，即得。

       ⑤　因中藥成分復(fù)雜且砷、汞含量差異較大，故本法中稱樣量?jī)H供參考。礦物藥及其制劑的取樣量一般應(yīng)折算至含砷量或含汞量20～30mg；動(dòng)、植物類中藥（除甲類、毛發(fā)類）的取樣量應(yīng)根據(jù)樣品中砷或汞的含量來確定適宜的量，一般為0.2～0.5g。

       ⑥　本法中規(guī)定的供試品溶液制備方法系通用性的推薦方法，實(shí)踐中可根據(jù)樣品基質(zhì)的不同而進(jìn)行參數(shù)的適當(dāng)調(diào)整，并在各品種項(xiàng)下另作詳細(xì)規(guī)定，同時(shí)進(jìn)行必要的方法驗(yàn)證。

       ⑦　供試品中汞或、砷形態(tài)或價(jià)態(tài)的限量應(yīng)符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定。

       三、2020版《中國(guó)藥典》執(zhí)行后展望

       根據(jù)監(jiān)管需要，對(duì)標(biāo)國(guó)際先進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)家藥典委員會(huì)官網(wǎng)發(fā)布了2322《汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定法》（第三次征求意見稿），將專屬性強(qiáng)、鑒別力好、成熟度高的檢驗(yàn)方法納入標(biāo)準(zhǔn)，合理升級(jí)了汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)的升級(jí)為推動(dòng)中藥材國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展將起到較好的引領(lǐng)作用，對(duì)提升板中藥材產(chǎn)品的國(guó)際影響力和競(jìng)爭(zhēng)力，推動(dòng)中藥材產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易發(fā)揮重要作用，國(guó)家藥監(jiān)部門明確表示，良藥走遍天下，劣藥寸步難行，再次給中藥行業(yè)質(zhì)量監(jiān)管敲響了警鐘，2020版《中國(guó)藥典》的制修訂更接地氣，緊密聯(lián)系監(jiān)管實(shí)際，及時(shí)滿足監(jiān)管需求，充分體現(xiàn)藥典標(biāo)準(zhǔn)的主要功能作用，即鼓勵(lì)好藥，淘汰劣藥，鑒別真?zhèn)危u(píng)判優(yōu)良，更好地為監(jiān)管服務(wù)，有關(guān)企業(yè)需提前領(lǐng)會(huì)汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)的創(chuàng)新和變化，做到清楚各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)涵，理解標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容，掌握標(biāo)準(zhǔn)操作，便于今后正確按照升級(jí)后標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

       參考文獻(xiàn)

       [1] www.chp.org.cn/view/ff8080816e444b7f016f180a38d536b0?a=BZFL

       作者簡(jiǎn)介：滴水司南，男，生物醫(yī)藥高級(jí)工程師，立足于生物醫(yī)藥行業(yè)質(zhì)量管理工作，專注于生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，希望在知識(shí)的海洋里，用簡(jiǎn)單的語言講述不簡(jiǎn)單的專業(yè)知識(shí)，提供一枚知識(shí)的指南針，指引讀者到達(dá)知識(shí)的彼岸。