佐劑一詞源自拉丁語單詞ad和juvare，意思是“幫助”。佐劑的作用是幫助引導(dǎo)共同給藥的疫苗抗原產(chǎn)生保護(hù)所需的免疫反應(yīng)。由于對(duì)其作用機(jī)制的了解不足，新的佐劑開發(fā)一直舉步不前。最近，Toll樣受體（TLRs）的發(fā)現(xiàn)徹底改變了這一領(lǐng)域，TLRs是一種先天免疫受體，直接或間接負(fù)責(zé)檢測(cè)病原體相關(guān)分子模式（PAMP），并通過激活先天和適應(yīng)性免疫途徑對(duì)其作出反應(yīng)。

       天然存在和合成的TLR激動(dòng)劑可以利用這些內(nèi)源性免疫信號(hào)通路來增強(qiáng)和調(diào)節(jié)疫苗反應(yīng)，從而使其成為優(yōu)良的疫苗佐劑。這不僅對(duì)開發(fā)針對(duì)傳染病的疫苗具有重要意義，而且對(duì)針對(duì)癌癥、過敏、阿爾茨海默病和其他疾病的免疫療法也具有重要意義。每種TLR都有自己的特定組織定位和下游基因信號(hào)通路，TLR激動(dòng)劑可以與其他TLR或替代佐劑組合，以產(chǎn)生具有協(xié)同或調(diào)節(jié)作用的組合佐劑，這為研究人員提供了精確定制具有特定免疫效果的佐劑的機(jī)會(huì)。

       TLR受體家族

       TLR受體家族包含六種跨膜TLR（TLR-1、2、4、5、6和10）和四種定位于內(nèi)涵體膜的TLR（TLC-3、7、8和9）。每種PAMP都被不同的TLR識(shí)別，即脂多糖（TLR4）、脂肽（TLR2與TLR6或TLR1）、鞭毛蛋白（TLR5）、單鏈RNA（TLR7/8）、雙鏈RNA（TLR3）和含CpG基序的DNA（TLR9）。

       在遇到特定的PAMP時(shí)，TLRs形成同源二聚體（TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9）或異二聚體（TLC1/2或TLR2/6）。配體誘導(dǎo)的TLRs二聚化使得銜接蛋白（MYD88）能夠結(jié)合到TIR結(jié)構(gòu)域。TLR3比較特別，該蛋白作為TLRs的通用銜接蛋白，利用含有TIR結(jié)構(gòu)域的誘導(dǎo)干擾素-β蛋白（TRIF）作為適配器蛋白。TLR受體和銜接蛋白的多樣性意味著TLR可以參與啟動(dòng)許多不同的下游免疫途徑。

       TLR信號(hào)傳導(dǎo)及其在免疫偏向中的作用

       TLRs的激活可以調(diào)節(jié)疫苗產(chǎn)生的免疫反應(yīng)類型。反應(yīng)類型由特定TLR及其銜接蛋白激活的信號(hào)通路決定。一般來說，大多數(shù)TLR途徑導(dǎo)致Th1免疫反應(yīng)，但TLR2除外，可能由于TLR2配體的多樣性，TLR2可以誘導(dǎo)促炎和抗炎途徑，導(dǎo)致Th1、Th0或Th2免疫反應(yīng)。

       除TLR3外，大多數(shù)TLR通過MyD88發(fā)揮作用。TLR激活后，MyD88募集由IL1受體相關(guān)激酶（IRAK）1、IRAK2和IRAK 4組成的寡聚復(fù)合物，并激活MyD88 TNF受體相關(guān)因子6（TRAF6）?；罨腡RAF6隨后觸發(fā)核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑，從而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子，如IL-12和TNF-α。TLR7和TLR9可以激活TRAF3磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7），從而產(chǎn)生IFN-α。此外，TLR3和TLR4已被證明通過其TRIF銜接蛋白募集TRAF3來誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生，從而激活I(lǐng)RF3。I型IFN應(yīng)答可誘導(dǎo)強(qiáng)Th1細(xì)胞/細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）應(yīng)答，該應(yīng)答對(duì)鑒定和清除感染或癌細(xì)胞很重要。TLR2受體主要誘導(dǎo)以高IL-10產(chǎn)生和低IL-12為特征的強(qiáng)Th2免疫反應(yīng)。

       TLR并不專門觸發(fā)Th1或Th2途徑，而是可以影響多種途徑。正是信號(hào)事件的平衡決定了免疫偏向。例如，一項(xiàng)研究表明，TLR4和TLR2激動(dòng)劑的激活可以通過p38 MAPK和ERK1/2-FOS途徑刺激信號(hào)傳導(dǎo)，分別導(dǎo)致IL-12或IL-10的產(chǎn)生；然而，TLR4在比TLR2更高的閾值下誘導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)傳導(dǎo)，而TLR2在比TLR4更高的閾下誘導(dǎo)ERK1/2信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致免疫極化。

       TLRs在適應(yīng)性免疫中的作用

       TLRs協(xié)調(diào)了從免疫細(xì)胞遷移到增強(qiáng)抗體親和力成熟的許多功能。TLRs作為危險(xiǎn)信號(hào)傳感器，增加了免疫細(xì)胞向疫苗給藥部位的運(yùn)輸。TLR參與可增強(qiáng)I類和II類MHC分子的抗原捕獲、處理和呈遞。某些特定類型的TLR可以不同程度地影響抗原的交叉呈遞，從而TLR3或TLR4，而不是TLR2或TLR7/8配體，減少CD8 +T細(xì)胞對(duì)抗原的攝取和交叉呈遞。TLR激活也可導(dǎo)致共刺激分子（如CD80和CD86）的上調(diào)，這對(duì)APC啟動(dòng)幼稚T細(xì)胞至關(guān)重要。DC細(xì)胞的TLR在自我/非自我抗原識(shí)別以及是產(chǎn)生免疫反應(yīng)還是免疫耐受中起著關(guān)鍵作用。不同類型的APC表達(dá)不同的TLR，例如髓系DC表達(dá)TLR2和TLR4，而漿細(xì)胞樣DC（pDC）表達(dá)TRL7和TLR9。因此，TLR對(duì)不同DC譜系的優(yōu)先激活可以影響隨后的免疫偏向。

       與小鼠相比，TLR在B細(xì)胞上的表達(dá)在人類中更為有限，人類主要表達(dá)TLR 2、7、9、10，TLR2配體需要通過B細(xì)胞受體（BCR）和TLR7的交聯(lián)進(jìn)行額外增敏，TLR7需要1型干擾素（IFN）引發(fā)。這些TLR激動(dòng)劑在體外誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖、活化和分化。最初，人們認(rèn)為TLRs只促進(jìn)B細(xì)胞的卵泡外反應(yīng)，其特征是快速產(chǎn)生低親和力抗體；然而，最近的研究表明，TLRs也可以增強(qiáng)生發(fā)中心反應(yīng)，從而產(chǎn)生高親和力抗體。TLR與BCR協(xié)同作用，誘導(dǎo)類轉(zhuǎn)換重組和抗體反應(yīng)的成熟。TLR4還增強(qiáng)了B細(xì)胞向引流淋巴結(jié)的遷移，并在此過程中加快了抗體類別的轉(zhuǎn)換。不適宜的B細(xì)胞TLR信號(hào)傳導(dǎo)與自身反應(yīng)性B細(xì)胞和自身免疫性疾病的產(chǎn)生有關(guān)；因此，在疫苗配方中避免過度的TLR刺激非常重要。

       TLR也已被證明能增強(qiáng)各種不同的T細(xì)胞亞群。幾項(xiàng)研究表明，TLRs可以作為CD8+T細(xì)胞的共刺激分子，促進(jìn)細(xì)胞增殖/存活、效應(yīng)器功能、細(xì)胞因子產(chǎn)生和記憶形成的增加。TLRs在Treg細(xì)胞中的作用仍然存在爭(zhēng)議。幾項(xiàng)研究表明，TLR2激動(dòng)劑可誘導(dǎo)Treg抑制活性的暫時(shí)喪失；而其他研究表明，盡管TLR2激動(dòng)劑可增加抗原特異性增殖，但Treg細(xì)胞仍保留其抑制功能。

       TLR佐劑的最新研究進(jìn)展

       疫苗配方中使用的TLR激動(dòng)劑有多種形式，從脂肽到單鏈DNA和RNA。下面介紹TLR佐劑的主要類別。

       TLR2

       TLR2在多種細(xì)胞表面表達(dá)，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、髓系抑制細(xì)胞、血小板和肥大細(xì)胞。TLR2識(shí)別的PAMP庫(kù)是最廣泛的，因?yàn)樗軌蚺cTLR1和TLR6（以及人類中的TLR10）形成異二聚體。

       TLR2佐劑的范圍很廣，包括合成脂肽（PAM3CSK4和PAM2CSK4）、阿拉伯甘露糖脂、脂磷壁酸、GPI膜錨定物、酵母多糖和肽聚糖。近年來TLR2研究的主要趨勢(shì)包括發(fā)現(xiàn)小型合成TLR2激動(dòng)劑、改進(jìn)傳統(tǒng)TLR2激動(dòng)物的特性以及TLR2與疫苗抗原的生物偶聯(lián)。例如，XS15（PAM3CS-GDPKHPKSF）是一種新的基于PAM3CS的TLR-1/2激動(dòng)劑，其中PAM3CSK4的四賴氨酸（K4）被九肽（GDPKHPKSF）取代，以改變偶聯(lián)物的水溶性，不僅促進(jìn)攝取，而且易于純化。使用TLR2激動(dòng)劑作為佐劑的局限性包括大多數(shù)配體的大小、復(fù)雜性和疏水性。

       TLR3

       TLR3是一種細(xì)胞內(nèi)識(shí)別系統(tǒng)，對(duì)病毒核酸（dsRNA、ssRNA和ssDNA）以及內(nèi)源性雙鏈RNA作出反應(yīng)。已經(jīng)開發(fā)了許多TLR3激動(dòng)劑，如RGC100和ARNAX，一種合成的DNA-RNA雜交化合物。然而，在過去兩年中，研究人員又回到了使用傳統(tǒng)的dsRNA模擬配體，如poly IC，重點(diǎn)是改進(jìn)其遞送模式和新的疾病應(yīng)用。

       TLR4

       TLR4是TLR家族中研究最多的成員，它識(shí)別脂多糖（LPS）。TLR4位于質(zhì)膜上，主要在髓系細(xì)胞上表達(dá)，而pDCs和幼稚B細(xì)胞不表達(dá)。TLR4通過其共受體骨髓分化因子-2（MD-2）和CD14識(shí)別LPS。最近關(guān)于TLR4激動(dòng)劑的工作集中在修飾產(chǎn)物的開發(fā)和評(píng)估上，如單磷酸脂質(zhì)A（MPLA）和吡喃葡萄糖脂質(zhì)A（GLA），它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上與LPS相關(guān)，但沒有高致熱原性并保持強(qiáng)免疫增強(qiáng)特性，從而增加了其臨床應(yīng)用的可行性。

       TLR5

       TLR5識(shí)別鞭毛蛋白，并在上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和未成熟DC）上表達(dá)，通過MyD88依賴性信號(hào)通路產(chǎn)生免疫反應(yīng)。最近關(guān)于TLR5激動(dòng)劑的工作主要集中在提高耐受性上。不幸的是，鞭毛蛋白會(huì)誘導(dǎo)不必要的過度反應(yīng)原性，作為一種蛋白質(zhì)，它可以誘導(dǎo)針對(duì)自身的抗體，干擾其作為佐劑的功能。有研究通過從鞭毛蛋白中去除B細(xì)胞表位區(qū)域解決了這一問題，脫免疫的鞭毛蛋白保留了其TLR5佐劑活性。

       TLR7/8

       TLR7和TLR8位于免疫細(xì)胞的內(nèi)涵體膜上。TLR7主要在pDC和B細(xì)胞中表達(dá)，而TLR8在髓系樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞中表達(dá)，在pDC中表達(dá)程度較低。TLR7/8識(shí)別單鏈核糖核酸（ssRNA），并通過MyD88依賴性途徑發(fā)出信號(hào)。在天然配體中，富含腺苷和尿苷的寡核苷酸（ORN）能夠激活TLR8，而對(duì)TLR7沒有任何影響，而富含鳥苷的ORN激活TLR7和TLR8依賴性信號(hào)傳導(dǎo)。TLR7以單體形式存在，并在配體存在下二聚，而TLR8以天然存在的弱二聚體存在，在配體結(jié)合時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化。目前已發(fā)現(xiàn)15種以上的新型雜環(huán)分子，如咪唑喹啉、蝶呤、嘧啶、吡啶嘧啶、吡 咯 嘧啶和苯并咪唑，被鑒定為TLR7/8激動(dòng)劑。

       TLR7/8激動(dòng)劑的一個(gè)常見缺點(diǎn)是反應(yīng)原性，近年來，有大量研究試圖克服這些副作用。將TLR7/8激動(dòng)劑封裝在基于陽離子DOEPC的脂質(zhì)體制劑納米顆粒中，或?qū)⑦@些小分子共價(jià)連接到超支化聚合物上，可以避免其有害的系統(tǒng)反應(yīng)，同時(shí)保持其對(duì)體液免疫的影響。

       TLR9

       TLR9在細(xì)胞內(nèi)定位于內(nèi)涵體膜中，識(shí)別細(xì)菌和病毒DNA的單鏈非甲基化CpG寡核苷酸。TLR9在免疫細(xì)胞上表達(dá)，如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和其他APC。合成CpG序列可用作TLR9激動(dòng)劑，以增強(qiáng)疫苗的免疫反應(yīng)，并且每種獨(dú)特的序列變異組合已被證明具有不同的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。

       TLR9激動(dòng)劑在過去兩年中的最新發(fā)展主要集中在CpG向細(xì)胞的有效遞送和攝取上。例如，一項(xiàng)研究介紹了一種將CpG-ODN偶聯(lián)到新型陽離子脂質(zhì)體上的新方法，該復(fù)合物能夠在低抗原和佐劑劑量下誘導(dǎo)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。

       組合TLR佐劑

       將不同TLR的激動(dòng)劑組合在單一疫苗中產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，可以驅(qū)動(dòng)強(qiáng)大的疫苗免疫反應(yīng)。例如，包含1V270（TLR7激動(dòng)劑）和2B182C（TLR4激動(dòng)劑）的脂質(zhì)體佐劑誘導(dǎo)了針對(duì)流感的平衡的抗HA和抗NA IgG1和IgG2a反應(yīng)，而沒有Th1促炎反應(yīng)常見的過度反應(yīng)原性。類似地，一項(xiàng)研究評(píng)估了卵清蛋白（OVA）與兩到三種TLR配體的十種獨(dú)特組合的共包封，包括Pam3CSK4（TLR2激動(dòng)劑）、MPLA（TLR4激動(dòng)劑），咪喹莫特（TLR7/8激動(dòng)劑）和CpG（TLR9激動(dòng)劑），而三重組合以總體平衡的Th1/Th2應(yīng)答促進(jìn)抗原特異性抗體滴度。因此，TLR佐劑的組合可以提供廣泛的定制免疫反應(yīng)。

       TLR激動(dòng)劑與其他PAMP如NOD2和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型Ca2的組合?-依賴性凝集素受體（Mincle）配體也很有前景。共價(jià)連接CL239（TLR7激動(dòng)劑）和胞壁酰二肽（NOD2激動(dòng)劑），并將雙激動(dòng)劑作為納米顆粒與NP-p24 HIV疫苗結(jié)合，協(xié)同作用增強(qiáng)了對(duì)小鼠的保護(hù)。

       小結(jié)

       TLR激動(dòng)劑利用內(nèi)源性先天免疫途徑增強(qiáng)疫苗適應(yīng)性免疫反應(yīng)。在過去兩年中，佐劑領(lǐng)域一直被新冠肺炎疫苗的研究所主導(dǎo)。這一流行病的推動(dòng)力迅速推動(dòng)了佐劑領(lǐng)域的發(fā)展，多種新佐劑現(xiàn)已被納入許可的新冠肺炎新疫苗中。除了新冠肺炎，對(duì)更有效佐劑的需求繼續(xù)增長(zhǎng)，特別是在癌癥和瘧疾、結(jié)核病和艾滋病毒等難以預(yù)防的傳染病領(lǐng)域。解開TLR聯(lián)合佐劑背后的作用機(jī)制，再加上更多的安全性和有效性研究數(shù)據(jù)，有助于推動(dòng)下一代佐劑平臺(tái)的發(fā)展。