5月31日，CDE 連發(fā)4條技術(shù)指導(dǎo)原則，分別為《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的通告（2022年第31號）、免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的通告（2022年第30號）、《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的通告（2022年第29號）、《局部給藥局部起效藥物臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的通告（2022年第32號）。

       具體內(nèi)容如下：

       《體外基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》

       一、前 言

       近年來，細(xì)胞治療和基因編輯等技術(shù)手段蓬勃發(fā)展，相關(guān)臨床醫(yī)療探索不斷深入，為嚴(yán)重和難治性疾病提供了新的治療理念和方法。日益增加的臨床需求促進(jìn)了基因操作新技術(shù)的應(yīng)用和更新。

       在人體外，采用基因工程技術(shù)構(gòu)建的修飾系統(tǒng),可有效地將遺傳物質(zhì)等轉(zhuǎn)入特定目的細(xì)胞，用于修飾目的細(xì)胞的遺傳物質(zhì)、改變基因表達(dá)方式或調(diào)節(jié)細(xì)胞生物特性等。目前， 慢病毒載體、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等常見用于將嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, CAR）基因?qū)?T 細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn) CAR-T 細(xì)胞對腫瘤的靶向殺傷；游離型載體（Episomal Vector）、仙臺病毒載體等可用于將轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入細(xì)胞，通過重編程獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，為其衍生細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)提供起始原材料。將來，預(yù)計(jì)會(huì)有更多樣的載體設(shè)計(jì)適用于不同類型的產(chǎn)品。

       基因修飾系統(tǒng)種類多樣，載體設(shè)計(jì)、制備過程以及質(zhì)量控制等方面的差異直接影響到最終產(chǎn)品的安全性和有效性， 且其來源可能不同，質(zhì)量管理體系存在差異。為保證基因修飾系統(tǒng)質(zhì)量符合臨床應(yīng)用的要求，需對其進(jìn)行充分的質(zhì)量研究。因此，有必要細(xì)化不同類型基因修飾系統(tǒng)藥學(xué)研究的技術(shù)要求。

       本指導(dǎo)原則基于當(dāng)前的科學(xué)認(rèn)知，針對體外用基因修飾系統(tǒng)提出申報(bào)上市階段的建議性技術(shù)要求，旨在為研發(fā)單位 提供指導(dǎo)意見，同時(shí)，也作為監(jiān)管機(jī)構(gòu)評價(jià)的重要參考。本 指導(dǎo)原則不具有強(qiáng)制性，若有可替代或適用的其他研究方法， 或本指導(dǎo)原則中有不適用的內(nèi)容，申請人/持有人可提供相 應(yīng)說明及相關(guān)替代研究的支持理由和依據(jù)。隨著技術(shù)的發(fā)展、認(rèn)知的深入和經(jīng)驗(yàn)的積累，針對本指導(dǎo)原則內(nèi)容后續(xù)將逐步 修訂和完善。

       二、適用范圍

       本指導(dǎo)原則中，基因修飾系統(tǒng)指在人體外，將外源基因等導(dǎo)入細(xì)胞，通過添加、替代、補(bǔ)償、阻斷、修正特定基因從而為獲得細(xì)胞治療產(chǎn)品或細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)用種子細(xì)胞而使用的修飾系統(tǒng)。可能的作用機(jī)制包括細(xì)胞內(nèi)表達(dá)功能性目的基因，或采用基因敲除、修復(fù)、插入等核苷酸編輯方式改變特定的基因序列等。

       目前，基因修飾系統(tǒng)包括慢病毒、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、仙臺病毒等病毒載體，以及 DNA、RNA、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-RNA 復(fù)合物等非病毒基因修飾系統(tǒng)。本指導(dǎo)原則對病毒載體類和非病毒載體類兩類基因修飾系統(tǒng)進(jìn)行論述。隨著本領(lǐng)域技術(shù)的不斷更迭，新的基因修飾系統(tǒng)也可能應(yīng)用，如適用，其藥學(xué)研究也可參考本指導(dǎo)原則。

       三、一般原則

       基因修飾系統(tǒng)的設(shè)計(jì)合理性、工藝穩(wěn)定性、質(zhì)量可控性可直接影響細(xì)胞終產(chǎn)品的安全性和有效性，是藥學(xué)研究的重點(diǎn)。需要開展的藥學(xué)研究，可能包括上游設(shè)計(jì)、制備工藝、質(zhì)量研究與控制、穩(wěn)定性研究等多個(gè)方面。基因修飾系統(tǒng)的制備全過程原則上應(yīng)符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP） 的要求，具體的要求根據(jù)其使用情形的不同可具體問題具體分析。

       基因修飾系統(tǒng)的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)雖與體內(nèi)基因治療產(chǎn)品有相似之處，但又有別于體內(nèi)基因治療產(chǎn)品。體外基因修飾后的細(xì)胞還可能經(jīng)過體外培養(yǎng)、換液清洗步驟，在應(yīng)用于人體之前還要經(jīng)過細(xì)胞終產(chǎn)品放行檢測。因此，基因修飾系統(tǒng)相較于體內(nèi)基因治療產(chǎn)品，其修飾特性可能在回輸前得到控制， 一些相關(guān)的雜質(zhì)殘留可以經(jīng)過質(zhì)量控制后進(jìn)行放行，需要結(jié)合其特點(diǎn)開展體外基因修飾系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和質(zhì)量研究與控制。

       （一）不同研發(fā)階段的一般要求

       同其他藥物的研發(fā)一樣，基因修飾系統(tǒng)的藥學(xué)研究也具有階段性、漸進(jìn)性等特征，隨細(xì)胞終產(chǎn)品非臨床和不同臨床試驗(yàn)階段研究的推進(jìn)而變化。研發(fā)者應(yīng)提前制定研究計(jì)劃和策略，鼓勵(lì)按照“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的理念進(jìn)行相關(guān)研究，隨著研發(fā)深入，逐步優(yōu)化制備工藝，加強(qiáng)質(zhì)量控制。

       臨床試驗(yàn)申報(bào)階段，需識別和控制基因修飾系統(tǒng)的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，明確其分子設(shè)計(jì)，完成生產(chǎn)用種子（如適用）的建庫和檢定，初步評估選用生產(chǎn)用原材料的合理性和安全性，通過工藝研究建立相對穩(wěn)定的制備工藝，開展相應(yīng)的質(zhì)量研究， 建立適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以確?；蛐揎椣到y(tǒng)及其所修飾細(xì)胞 臨床應(yīng)用的安全性。

       基因修飾系統(tǒng)應(yīng)用于申報(bào)上市階段的細(xì)胞產(chǎn)品時(shí)，隨著對工藝和質(zhì)量屬性認(rèn)識的加深，工藝不斷優(yōu)化，經(jīng)過充分的工藝開發(fā)及驗(yàn)證研究確定基因修飾系統(tǒng)的商業(yè)化工藝。

       如果在臨床試驗(yàn)期間，基因修飾系統(tǒng)的工藝發(fā)生變更， 需完成基因修飾系統(tǒng)和相應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)品的可比性研究；建議在確證性臨床試驗(yàn)前，完成重大變更，并確定工藝。基于充分深入的質(zhì)量研究和多批次數(shù)據(jù)積累，制定合理的質(zhì)量控制策略，明確關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Atribute，CQA）， 確定適宜的分析方法，進(jìn)行全面的方法學(xué)驗(yàn)證；同時(shí)，應(yīng)關(guān)注修飾系統(tǒng)相關(guān)或工藝相關(guān)的雜質(zhì)研究，并制定相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制策略。規(guī)范開展并完成穩(wěn)定性研究和包材相容性研究， 制定合理的貯存條件和時(shí)間。

       （二）不同來源基因修飾系統(tǒng)的一般要求

       基因修飾系統(tǒng)可能存在自行生產(chǎn)、委托生產(chǎn)、購買等多種來源，不同來源基因修飾系統(tǒng)遵循相同的技術(shù)要求和質(zhì)量控制原則，藥學(xué)研究均可參考本指導(dǎo)原則開展。

       細(xì)胞終產(chǎn)品的上市許可持有人應(yīng)對基因修飾系統(tǒng)的質(zhì)量負(fù)主體責(zé)任，通過加強(qiáng)內(nèi)部質(zhì)量控制或?qū)蛐揎椣到y(tǒng)生產(chǎn)方的審核、制定質(zhì)量協(xié)議等控制相應(yīng)的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。如果基因修飾系統(tǒng)發(fā)生變更，應(yīng)及時(shí)評估風(fēng)險(xiǎn)，開展相應(yīng)的藥學(xué)可比性研究，在某些情況下可能還需要非臨床或/和臨床橋接研究。

       四、風(fēng)險(xiǎn)評估與控制

       （一）整體風(fēng)險(xiǎn)識別與控制策略

       基因修飾系統(tǒng)涉及的風(fēng)險(xiǎn)主要包括病毒載體回復(fù)突變、載體在基因組中整合致癌或致病、脫靶風(fēng)險(xiǎn)、外源因子污染、雜質(zhì)殘留等。

       藥學(xué)研究可從修飾系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、制備工藝和質(zhì)量控制等多個(gè)方面開展風(fēng)險(xiǎn)因素的分析，識別、確定與產(chǎn)品質(zhì)量和安全性相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素,確定研發(fā)期間所需進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估的數(shù)據(jù)范圍和重點(diǎn)，并制定風(fēng)險(xiǎn)防控和處理措施。同時(shí)，需結(jié)合細(xì)胞類型、劑量、給藥途徑、使用人群、作用機(jī)制、體內(nèi)分布、體內(nèi)作用時(shí)間等方面綜合考慮風(fēng)險(xiǎn)。

       基因修飾系統(tǒng)設(shè)計(jì)方面，典型風(fēng)險(xiǎn)因素可能包括：風(fēng)險(xiǎn)元件的使用，同源序列可能導(dǎo)致的序列重組，病毒載體經(jīng)相應(yīng)野生型或輔助病毒互補(bǔ)后產(chǎn)生回復(fù)突變,載體在細(xì)胞中潛伏/再激活和/或動(dòng)員，載體在細(xì)胞染色體整合程度和整合位點(diǎn)的偏好性等。制備工藝方面，相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素可能包括：高風(fēng)險(xiǎn)原材料的使用，制備過程中外源因子的污染，中間產(chǎn)物的貯存和質(zhì)量控制，有害雜質(zhì)的引入與生成，以及修飾系統(tǒng)的基因序列穩(wěn)定性等。質(zhì)量控制方面，相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素可能包括：檢測方法的適用性、標(biāo)準(zhǔn)限度的合理性等。

       近年來，基于酶的基因編輯系統(tǒng)逐漸應(yīng)用于細(xì)胞治療產(chǎn)品的基因修飾，常見的系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、規(guī)律性重復(fù)短回文序列簇-相關(guān)蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated protein，Cas）等。該類系統(tǒng)的臨床使用風(fēng)險(xiǎn)主要包括基因

       工具酶的自身**、免疫原性、基因編輯時(shí)基因上靶、脫靶導(dǎo)致的**和雜質(zhì)殘留等。

       因此，應(yīng)根據(jù)多方面因素，結(jié)合細(xì)胞終產(chǎn)品的特點(diǎn)，針 對不同類型基因修飾系統(tǒng)的特性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估和控制。例如， 根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評估情況，合理設(shè)計(jì)修飾系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和序列，避免 使用致癌元件等高風(fēng)險(xiǎn)的元件，進(jìn)行相關(guān)檢測，盡可能降低 同源重組和病毒載體回復(fù)突變的可能性；對高風(fēng)險(xiǎn)的生產(chǎn)原 材料進(jìn)行質(zhì)量控制，在適當(dāng)?shù)闹苽洵h(huán)節(jié)，設(shè)定過程控制的檢 測項(xiàng)目和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)；根據(jù)修飾系統(tǒng)作用機(jī)理，針對基因序列 穩(wěn)定性等安全性相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素開展研究等。在細(xì)胞終產(chǎn)品 生命周期內(nèi)對修飾系統(tǒng)進(jìn)行跟蹤分析和更新，收集數(shù)據(jù)以進(jìn) 一步確定其風(fēng)險(xiǎn)特征并制定控制策略。

       （二）不同生產(chǎn)使用情形的風(fēng)險(xiǎn)

       基因修飾系統(tǒng)在細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的使用情形可能不同，目前研究可能包括體外基因修飾后直接制備細(xì)胞產(chǎn)品（情形一）和體外基因修飾后建系/庫再制備細(xì)胞產(chǎn)品（情形二）兩種使用情形。兩種使用情形相應(yīng)基因修飾系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)不同，其藥學(xué)研究的要求可能存在差異，需要具體問題具體分析。

       對于情形一，基因修飾系統(tǒng)建議在 GMP 的條件下制備， 該情形下所用的基因修飾系統(tǒng)與回輸人體的細(xì)胞直接接觸， 應(yīng)關(guān)注該系統(tǒng)生產(chǎn)用原材料的質(zhì)量控制、批次間的質(zhì)量差異、雜質(zhì)水平等可能影響細(xì)胞治療產(chǎn)品安全性、有效性的研究內(nèi) 容。本指導(dǎo)原則后文主要論述該情形。

       對于情形二，基因修飾系統(tǒng)用于細(xì)胞系/庫的建立，其 序列的設(shè)計(jì)、生產(chǎn)用材料、制備工藝、質(zhì)量、穩(wěn)定性、內(nèi)包 材的要求可依具體情況，結(jié)合細(xì)胞系/庫的質(zhì)量研究結(jié)果進(jìn) 行綜合評估。由于基因修飾系統(tǒng)使用情況的復(fù)雜性（如一次 使用或多次使用），可結(jié)合生產(chǎn)使用情況和細(xì)胞系/庫的研究 和檢測情況，制定修飾系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)控制策略。良好的基因修 飾系統(tǒng)質(zhì)量研究與控制有利于篩選、建立出質(zhì)量良好的細(xì)胞 系/庫，有利于后續(xù)的生產(chǎn)研究。細(xì)胞系/庫建立過程中，建 議進(jìn)行單克隆篩選，對細(xì)胞系/庫進(jìn)行檢定和傳代穩(wěn)定性研 究，關(guān)注細(xì)胞系/庫功能是否符合理論設(shè)計(jì)和預(yù)期、安全是 否可控，必要時(shí)對細(xì)胞終產(chǎn)品進(jìn)行基因修飾相應(yīng)的質(zhì)量研究， 以確認(rèn)基因修飾系統(tǒng)的適用性。

       （三）變更風(fēng)險(xiǎn)

       隨著基因修飾技術(shù)不斷更新和研究經(jīng)驗(yàn)的逐步積累，研發(fā)過程常常伴隨基因修飾系統(tǒng)的升級和工藝的優(yōu)化，因此研發(fā)各階段基因修飾系統(tǒng)有可能發(fā)生變更。

       基因修飾系統(tǒng)變更可能顯著影響細(xì)胞產(chǎn)品的安全性和有效性，是細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究的重要風(fēng)險(xiǎn)之一，研發(fā)者需評估變更引入的影響和風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評估情況，對基因修飾系統(tǒng)及其細(xì)胞終產(chǎn)品（如適用）的質(zhì)量、工藝控制、穩(wěn)定性等方面進(jìn)行深入研究，合理設(shè)計(jì)變更可比性研究方案。

       五、基因修飾系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、制備和質(zhì)量控制

       （一）病毒載體類基因修飾系統(tǒng)

       1. 病毒載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

       1.1 目的基因及調(diào)控元件

       目的基因是基因修飾系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)預(yù)期功能的關(guān)鍵序列， 調(diào)控元件是影響目的基因序列轉(zhuǎn)錄、翻譯和穩(wěn)定性的重要序列。研發(fā)者應(yīng)基于細(xì)胞終產(chǎn)品的安全性和有效性，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評估，進(jìn)行基因修飾系統(tǒng)各元件的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。

       目的基因：本文中是指基因修飾系統(tǒng)傳遞、表達(dá)的遺傳物質(zhì)，研發(fā)者應(yīng)結(jié)合其在疾病治療中的作用或作用機(jī)理謹(jǐn)慎選用和設(shè)計(jì)目的基因序列，關(guān)注目的基因的來源、序列篩選及優(yōu)化過程，明確完整的核苷酸、氨基酸（如適用）序列信息，并建議與數(shù)據(jù)庫收錄的相關(guān)序列進(jìn)行序列比對。目的基因的優(yōu)化中，應(yīng)闡述分子改構(gòu)的科學(xué)評估及驗(yàn)證研究考慮，如人源化改構(gòu)，敲減元件，自殺標(biāo)記，以及為調(diào)控高級結(jié)構(gòu)形成或?yàn)檫m應(yīng)載體大小進(jìn)行的序列改造和刪減等。同時(shí)，建議結(jié)合目的基因或其表達(dá)產(chǎn)物與靶分子的特異性結(jié)合能力， 評估潛在的非特異性效應(yīng)等。可以結(jié)合目的基因序列特征、目的蛋白與細(xì)胞基因組的相互作用等，充分考慮目的基因?qū)δ康募?xì)胞基因組穩(wěn)定性的影響。如目的基因?qū)儆诜侨嗽椿蚋臉?gòu)的序列等，也可結(jié)合種屬間目的基因序列差異和表達(dá)產(chǎn)物的免疫特性，評估目的基因的免疫原性。

       調(diào)控元件：功能性元件對目的基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)具有重 要調(diào)控作用，研發(fā)者應(yīng)關(guān)注其設(shè)計(jì)原理并進(jìn)行確認(rèn)研究?？?以根據(jù)目的基因的表達(dá)量、預(yù)期作用和持續(xù)時(shí)間以及目的細(xì) 胞的類型等合理選擇和設(shè)計(jì)調(diào)控元件，相關(guān)的調(diào)控元件可能 包括信號肽、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、隔離子、5’ 非翻譯區(qū)、3’非翻譯區(qū)、多聚腺苷酸信號區(qū)、內(nèi)含子、其他 增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯效率相關(guān)元件、復(fù)制起始位點(diǎn)、額外引入的 基因序列等。各調(diào)控元件的序列來源及選擇依據(jù)應(yīng)明確。例 如啟動(dòng)子設(shè)計(jì)方面，建議結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞類型、目的基因表達(dá) 時(shí)間和表達(dá)量的需求、啟動(dòng)子的人用經(jīng)驗(yàn)等分析其啟動(dòng)子使 用的安全性，在風(fēng)險(xiǎn)評估的基礎(chǔ)上合理選用。調(diào)控元件設(shè)計(jì) 時(shí)需充分考慮元件的安全性和有效性，關(guān)注相關(guān)序列引入的 必要性和合理性，盡量避免使用高風(fēng)險(xiǎn)的元件，如必需使用， 應(yīng)進(jìn)行相關(guān)序列的安全性改構(gòu)。對于序列改構(gòu)或優(yōu)化的元件，均應(yīng)明確序列更改的依據(jù)與安全性考慮。此外，還建議關(guān)注功能元件設(shè)計(jì)對細(xì)胞基因組內(nèi)源性基因的干擾。

       1.2 病毒載體

       病毒載體通?？梢苑€(wěn)定、高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)目的基因至目的細(xì)胞中發(fā)揮作用。病毒載體的選擇和設(shè)計(jì)可綜合考慮目的基因表達(dá)時(shí)間、表達(dá)量，病毒載體的致病性、整合能力、感染過程、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、細(xì)胞**以及細(xì)胞產(chǎn)品的細(xì)胞類型、作用機(jī)制、臨床適應(yīng)癥、給藥方法等多方面。病毒載體的結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略包括提高病毒穩(wěn)定性、增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)率、拓寬可轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞類型等。

       目前常用的病毒載體通常進(jìn)行了毒力、致病性或復(fù)制能力相關(guān)基因的刪除，以確保使用的安全性。設(shè)計(jì)中，應(yīng)盡可能降低與野生型病毒相關(guān)的任何致病性，并盡可能將病毒重組和回復(fù)突變的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。對于改構(gòu)的病毒載體需關(guān)注親本病毒的來源、培養(yǎng)歷史和生物學(xué)特性等，對改構(gòu)用材料、方法、步驟及鑒定進(jìn)行充分研究。病毒載體進(jìn)行改構(gòu)時(shí)，不應(yīng)引入新的安全風(fēng)險(xiǎn)。

       下面以目前研究中常見的病毒載體為例進(jìn)行說明。

       1.2.1 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（γ-Retroviral Vector）

       γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒可逆轉(zhuǎn)錄其 RNA 基因組成為 DNA 拷貝， 病毒 DNA 隨機(jī)整合進(jìn)入有絲分裂活躍的細(xì)胞基因組。目前， 體外基因修飾用 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體常見有鼠白血病病毒（Murine Leukaemia Viruses，MuLV），貓白血病病毒（Feline Leukaemia Virus，F(xiàn)eLV）和長臂猿白血病病毒（Gibbon Ape Leukaemia Virus，GALV）等載體。其基因設(shè)計(jì)與改造主要包括提高載體安全性和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有效性。

       γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可通過轉(zhuǎn)移質(zhì)粒（含有目的基因）、 輔助質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)細(xì)胞進(jìn)行病毒載體包裝，也可通過整合了轉(zhuǎn)移 質(zhì)粒序列、輔助包裝元件的穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞系制備。為提升基 因修飾載體的安全性，建議對修飾系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，例如使用 刪除了非必需元件、經(jīng)充分改構(gòu)、安全性級別較高的 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，盡可能將病毒重組和回復(fù)突變的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。具體優(yōu)化操作還可能包括使用異源啟動(dòng)子和異源 polyA 信號表達(dá)輔助包裝元件、將輔助包裝元件拆分于不同質(zhì)粒表達(dá)、改造長末端重復(fù)序列（Long terminal repeat，LTR）使得末端自失活（Self Inactivating, SIN）等方式。

       基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有效性方面，鼓勵(lì)研發(fā)者對病毒載體包裝元件進(jìn)行優(yōu)化，提高病毒載體包裝效率、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等，如將 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的包膜蛋白替換為其他包膜蛋白以提高病毒穩(wěn)定性等。針對改造情況，需進(jìn)行充分的研究與驗(yàn)證。

       1.2.2 慢病毒載體（Lentiviral Vector）

       慢病毒載體通過介導(dǎo)目的基因整合至細(xì)胞基因組發(fā)揮作用，與 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只能感染有絲分裂活躍的細(xì)胞不同，慢病毒載體能感染有絲分裂活躍和不活躍的細(xì)胞。目前， 體外基因修飾用慢病毒載體常見有人慢病毒、非人靈長類和非靈長類慢病毒等載體。使用非人靈長類和非靈長類慢病毒載體時(shí)建議關(guān)注產(chǎn)生重組病毒嵌合體和/或跨物種傳播的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。慢病毒載體的設(shè)計(jì)與改造主要包括提高載體安全性和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有效性。

       慢病毒載體制備和臨床使用的主要風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)包括：產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒（Replication-competent lentivirus，RCL），發(fā)生體內(nèi)重組，以及在相關(guān)基因中或其附近插入前病毒 DNA 從而可能引起或促進(jìn)腫瘤發(fā)生和其他細(xì)胞病變等。因此，慢病毒載體設(shè)計(jì)方面，建議采用所有可能降低慢病毒致病風(fēng)險(xiǎn)的措施，包括不同包裝基因分離于不同質(zhì)粒表達(dá)（如 gag/pol 和 rev 分離），降低輔助質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒間的序列同源性，刪除不必要的調(diào)控元件，改造 LTR 使得末端自失活等。對于轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，鼓勵(lì)進(jìn)行序列優(yōu)化，提高安全性，如降低啟動(dòng)子插入目的細(xì)胞引起原癌基因活化的幾率等。

       為了提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)有效性，可考慮采用替換包膜蛋白、提升定點(diǎn)整合能力等改造策略。例如，人類免疫缺陷病毒（HIV）衍生的慢病毒載體，可通過用編碼異源病毒包膜蛋白（如 VSV-G）的基因替換 HIV 包膜蛋白基因序列來制備以增強(qiáng)載體的親嗜性和穩(wěn)定性。通過對整合酶和 LTR 等序列進(jìn)行改造，提升慢病毒載體的定點(diǎn)整合性能。對載體改造的同時(shí)，建議關(guān)注病毒載體穩(wěn)定性的變化、整合位點(diǎn)的偏好性等可能引入的風(fēng)險(xiǎn)。

       1.2.3 仙臺病毒載體（Sendai Viral Vector）

       仙臺病毒載體是在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)目的基因，通常不整合于細(xì)胞基因組中的單鏈反義 RNA 病毒載體。目前有研究將其應(yīng)用于細(xì)胞重編程建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系（iPSC）的過程中。設(shè)計(jì)和構(gòu)建時(shí)，在穩(wěn)定表達(dá)目的基因的同時(shí)，為防止產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒顆粒，可考慮刪除或改構(gòu)病毒組裝相關(guān)蛋白，例如參與病毒組裝的核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白以及基質(zhì)蛋白等。為確保有效地控制 iPSC 中仙臺病毒載體的殘留量，可以考慮改構(gòu)復(fù)制相關(guān)元件，例如通過 RNA 聚合酶的突變等方式， 構(gòu)建具有溫度依賴型復(fù)制能力的仙臺病毒載體；同時(shí)，需建立相關(guān)方法檢測和驗(yàn)證仙臺病毒載體在 iPSC 克隆中是否殘留以控制風(fēng)險(xiǎn)。

       其他病毒載體還可能包括腺病毒、腺相關(guān)病毒等載體， 其分子設(shè)計(jì)和構(gòu)建可以結(jié)合特定病毒結(jié)構(gòu)、目的基因序列特征、包裝序列的安全性等綜合考慮?；驹瓌t可參考上述內(nèi)容。

       2. 生產(chǎn)用物料

       2.1 質(zhì)粒

       對于采用多個(gè)質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染方式制備的病毒載體，需根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)、結(jié)合載體特性等，開展相應(yīng)的質(zhì)粒設(shè)計(jì)構(gòu)建、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性等研究。

       設(shè)計(jì)和構(gòu)建：根據(jù)研究，選擇合理的質(zhì)粒骨架、質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)、啟動(dòng)子以及選擇性標(biāo)記等組成元件，刪除非必需元件（特別是致癌等風(fēng)險(xiǎn)較高的序列），并完整確認(rèn)質(zhì)粒的核苷酸序列。質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)一般應(yīng)避免使用 β-內(nèi)酰胺類抗生素抗性基因，且質(zhì)粒設(shè)計(jì)時(shí)建議最 大 程 度防止抗性基因序列插入病毒載體基因組中，鼓勵(lì)開發(fā)研究采用非抗性基因篩選的質(zhì)粒。采用額外的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄或翻譯的元件時(shí)，應(yīng)充分評估其功能性和安全性，在必要時(shí)，進(jìn)行相應(yīng)的安全性改造，如土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件（Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, WPRE）等。建議盡可能將不同包裝元件拆分于多個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，以降低同源重組發(fā)生的概率。

       生產(chǎn)工藝：根據(jù)工藝研究情況，通過對關(guān)鍵工藝參數(shù)的探索和優(yōu)化，確定穩(wěn)定的質(zhì)粒規(guī)模化生產(chǎn)工藝，生產(chǎn)工藝應(yīng)有明確的生產(chǎn)規(guī)模、工藝流程、工藝步驟的詳細(xì)描述以及過程控制策略等。質(zhì)粒生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量避免使用人源和動(dòng)物源性材料，避免使用 β-內(nèi)酰胺類抗生素，如需使用其他種類的抗生素，應(yīng)對抗生素的殘留量進(jìn)行控制和安全性評估。基于研發(fā)階段和風(fēng)險(xiǎn)評估，開展質(zhì)粒工藝驗(yàn)證或確認(rèn)研究，如工藝過程控制確認(rèn)、中間產(chǎn)物貯存穩(wěn)定性研究、多批次質(zhì)量分析以及雜質(zhì)清除研究等。

       質(zhì)量控制：需建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并進(jìn)行放行檢驗(yàn)。質(zhì)粒放行的質(zhì)控項(xiàng)目一般包括：pH 值、外觀、鑒別（限制性內(nèi)切酶分析和測序）、質(zhì)粒濃度 / 含量、純度與雜質(zhì)（A260/A280、超螺旋比例、宿主菌 DNA 殘留、宿主菌 RNA 殘留、宿主蛋白殘留、抗生素殘留（如適用））、無菌及細(xì)菌內(nèi)毒素等。

       穩(wěn)定性研究：選擇合理、敏感的考察項(xiàng)目（如超螺旋比例等）進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測，根據(jù)研究結(jié)果制定合理的貯存條件和有效期。

       2.2 細(xì)菌種子批

       本指導(dǎo)原則細(xì)菌種子批指通過將病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)單克隆篩選及培養(yǎng)傳代后建立的種子庫。對于選用的宿主菌，需充分考慮宿主菌的來源、基因型、表型、既往使用經(jīng)驗(yàn)和生產(chǎn)需求等因素，如使用新型菌株，需關(guān)注其可能引入的額外風(fēng)險(xiǎn)。

       細(xì)菌種子批的建立：根據(jù)研究建立各級細(xì)菌種子批，明確制備規(guī)模、擴(kuò)增條件、貯存條件等。研究中關(guān)注目標(biāo)克隆篩選的情況，關(guān)注用于生成種子批的材料的來源、生產(chǎn)過程等以評估分析安全性風(fēng)險(xiǎn)。

       細(xì)菌種子批的質(zhì)量控制：建立適宜的放行檢測項(xiàng)目、標(biāo)準(zhǔn)和檢測方法。檢測項(xiàng)目一般包括細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒別、染色鏡檢、生化特性分析、抗性檢查、質(zhì)粒限制酶切圖譜分析、目的基因和其他元件序列準(zhǔn)確性分析等。檢測方法需經(jīng)過研究確認(rèn)和/或驗(yàn)證。通過質(zhì)量控制應(yīng)確保不存在其它細(xì)菌、真菌和噬菌體的污染，以及確保目的基因序列和其他元件序列的準(zhǔn)確性。

       細(xì)菌種子批穩(wěn)定性研究：傳代穩(wěn)定性一般包括質(zhì)粒大小、質(zhì)粒序列準(zhǔn)確性、質(zhì)粒限制酶切圖譜、質(zhì)粒保有率、質(zhì)?？?貝數(shù)等，根據(jù)研究結(jié)果明確種子批的限定傳代代次。貯存穩(wěn) 定性建議關(guān)注在貯存條件下和時(shí)長內(nèi)種子批的活率等。

       2.3 生產(chǎn)/包裝細(xì)胞庫

       病毒載體制備涉及的細(xì)胞基質(zhì)包括包裝病毒載體用細(xì)胞基質(zhì)和可以穩(wěn)定產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞基質(zhì)。選擇細(xì)胞基質(zhì)時(shí)，需要考慮病毒載體包裝和制備的可行性，結(jié)合細(xì)胞來源（包括物種來源）、生長特性和載體制備能力，以及可能影 響最終產(chǎn)品安全性的細(xì)胞特征等，選擇適合的細(xì)胞基質(zhì)。風(fēng) 險(xiǎn)評估時(shí)，要充分考慮細(xì)胞基質(zhì)中是否存在內(nèi)源性病毒顆粒、致癌序列等。對于新建立的細(xì)胞基質(zhì)或具有相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)胞基質(zhì)（如腫瘤細(xì)胞來源的細(xì)胞），適用的情況下應(yīng)評估細(xì)胞 的成瘤性和致瘤性。有些情況下，需要對細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行修飾（例如插入特定病毒蛋白表達(dá)序列允許病毒復(fù)制或包裝），研究中應(yīng)該關(guān)注修飾后細(xì)胞的遺傳、表觀和生長等特性以及病毒載體制備情況等。細(xì)胞基質(zhì)選定和/或修飾后需建立細(xì)胞庫，以確保生產(chǎn)的穩(wěn)定性和一致性。可參照《中國藥典》、ICH Q5A、ICH Q5D 等相關(guān)要求對細(xì)胞庫進(jìn)行檢定。檢測項(xiàng)目需根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評估確定，至少包括鑒別、無菌、支原體、螺原體（昆蟲細(xì)胞）以及內(nèi)、外源病毒因子、種屬特異性病毒等。開展細(xì)胞庫傳代穩(wěn)定性研究，包括細(xì)胞生長穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性、病毒載體包裝能力穩(wěn)定性等，建議研究中納入病毒載體的生產(chǎn)終末細(xì)胞或平行生產(chǎn)的對照細(xì)胞，擬定適合病毒載體制備的細(xì)胞限傳代次。

       包裝病毒載體用細(xì)胞庫：細(xì)胞庫細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)增、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后合成病毒載體基因序列、表達(dá)載體蛋白，并最終形成病毒載體顆粒。例如，目前慢病毒載體包裝常見使用 HEK293T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)入該細(xì)胞的質(zhì)粒 LTR 之間的 DNA 片段被轉(zhuǎn)錄成RNA，由輔助質(zhì)粒表達(dá)的蛋白將其包裝形成病毒載體顆粒。需要關(guān)注的是，當(dāng)病毒載體與非載體 DNA 序列（如質(zhì)粒DNA、輔助病毒序列、細(xì)胞 DNA 等）共同包裝時(shí)，非載體DNA 序列可能與病毒載體同源重組，或其殘留可能產(chǎn)生致癌風(fēng)險(xiǎn)，建議開展風(fēng)險(xiǎn)分析與研究，評估細(xì)胞基質(zhì)選用的合理性。例如使用含有腺病毒 E1、SV40LT 抗原等風(fēng)險(xiǎn)元件的細(xì)胞基質(zhì)包裝慢病毒載體時(shí)，應(yīng)關(guān)注載體中腺病毒 E1 和SV40LT 抗原序列的殘留量。

       可以穩(wěn)定產(chǎn)生病毒載體的細(xì)胞庫：細(xì)胞基質(zhì)經(jīng)基因修飾、篩選、建庫后可穩(wěn)定表達(dá)或產(chǎn)生病毒包裝用蛋白或元件，完 成病毒包裝和制備。例如，γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體制備常見使用小鼠 PG13、HEK293-Phoenix 細(xì)胞等，生產(chǎn)用細(xì)胞需穩(wěn)定表達(dá) gag-pol、包膜蛋白、目的基因等。構(gòu)建過程中建議關(guān)注其病毒包裝效率和所產(chǎn)病毒載體的質(zhì)量，并降低內(nèi)、外源因子污染和復(fù)制型病毒產(chǎn)生等安全性風(fēng)險(xiǎn)。穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞系需經(jīng)過基因修飾并通過單克隆篩選獲得，獲得的單克隆細(xì)胞系需建立細(xì)胞庫，并進(jìn)行全面的檢定。同時(shí)，開展細(xì)胞傳代穩(wěn)定性研究，關(guān)注不同代次穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞中插入基因片段的遺傳穩(wěn)定性以及病毒載體的產(chǎn)量和質(zhì)量等。

       2.4 病毒種子批

       通過病毒種子制備病毒載體或者輔助病毒的，需建立病毒種子批。病毒種子的來源、歷史培養(yǎng)情況等需清晰明確， 且風(fēng)險(xiǎn)可控。對于培養(yǎng)歷史不清晰，存在其他病毒污染風(fēng)險(xiǎn)， 或毒株單克隆性無法確認(rèn)的病毒種子，不建議使用，如確需使用，可以在構(gòu)建過程中進(jìn)行多輪噬斑純化、有限稀釋純化或通過 DNA/RNA 克隆拯救等，以確保毒株的純度和單克隆性。

       種子批的建立過程、代次、貯存和維護(hù)等信息應(yīng)清晰、明確；如有，應(yīng)說明種子批制備過程使用的人源/動(dòng)物源材料，并進(jìn)行安全性評估。

       病毒種子批應(yīng)經(jīng)過充分檢測，檢測項(xiàng)目建議包括：無菌、支原體以及外源病毒因子、病毒載體和目的基因的鑒別與測序、病毒滴度或濃度、生物學(xué)活性、雜質(zhì)、對抗病毒 藥物的敏感性（如適用）、回復(fù)突變（如適用）等。建議對病毒種子批進(jìn)行全基因測序，并對測序結(jié)果與預(yù)期序列進(jìn)行對比分析，如有，需對所有差異進(jìn)行評估。對于序列較長的病毒載體，建議最 大 程 度進(jìn)行序列分析，所分析的序列建議包括基因插入片段、側(cè)翼區(qū)域以及載體中被修飾或可能易于重組的區(qū)域。

       病毒種子批需開展全面的傳代穩(wěn)定性研究，研究過程應(yīng)能代表或模擬實(shí)際制備工藝，研究中關(guān)注病毒種子批的遺傳穩(wěn)定性和生產(chǎn)穩(wěn)定性等。根據(jù)研究，制定病毒種子批的限定傳代代次。

       如病毒載體制備過程使用了輔助病毒，應(yīng)開展充分的研究說明輔助病毒使用的必要性和選擇依據(jù)，結(jié)合科學(xué)認(rèn)知及生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)說明輔助病毒的安全性。輔助病毒的設(shè)計(jì)構(gòu)建、建庫、生產(chǎn)制備和檢定建議參考上述病毒種子批的一般要求。

       2.5 其他生產(chǎn)用物料

       其他生產(chǎn)用物料包括原材料（如試劑、培養(yǎng)基等）、耗材、培養(yǎng)容器等。結(jié)合工藝研究，選用適宜的生產(chǎn)用原材料， 制定合理的原材料質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行嚴(yán)格的供應(yīng)商審計(jì)， 明確生產(chǎn)用原材料的來源、組分、功能、使用階段、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等。制備過程中盡量避免使用人或動(dòng)物來源的成分，如果確需使用，可參考《中國藥典》相關(guān)規(guī)定和/或 ICH Q5A 等指南開展外源因子等安全性相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)評估與研究。需要重點(diǎn)關(guān)注的原材料包括：用于細(xì)胞培養(yǎng)的人或動(dòng)物源材料（如牛血清、消化酶），質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑（如聚乙烯亞胺、陽離子脂質(zhì)等），核酸酶等。對于病毒載體制備或貯存時(shí)使用的人血白蛋白等風(fēng)險(xiǎn)較高的制品，建議盡可能選用經(jīng)監(jiān)管部門批準(zhǔn)，并符合國家相關(guān)技術(shù)要求和管理規(guī)范的產(chǎn)品。對于耗材和培養(yǎng)容器，建議經(jīng)過分析和研究，評估其適用性，盡量降低病毒載體制備過程中的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

       3. 制備工藝

       病毒載體的制備工藝是指從生產(chǎn)用細(xì)胞的復(fù)蘇擴(kuò)增、病毒載體的收獲到病毒載體灌裝、貯存（如有）的全過程。對于體外基因修飾后直接制備細(xì)胞產(chǎn)品的病毒載體系統(tǒng)，由于病毒載體質(zhì)量可直接影響終產(chǎn)品質(zhì)量，因此其制備工藝研究應(yīng)更加充分完善。在對整體工藝的充分理解和對病毒載體質(zhì)量的累積經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上制定制備工藝，建立規(guī)范的工藝操作步驟、工藝控制參數(shù)和廢棄標(biāo)準(zhǔn)，并明確關(guān)鍵工藝參數(shù)。制備工藝應(yīng)適用于確保細(xì)胞產(chǎn)品符合對應(yīng)開發(fā)階段的質(zhì)量目標(biāo)產(chǎn)品概況的要求。另外，還應(yīng)采取措施避免病毒載體在制備、貯存、運(yùn)輸?shù)恼麄€(gè)過程中發(fā)生混淆、污染與交叉污染等。

       3.1 制備規(guī)模和批次定義

       不同類型病毒載體的生產(chǎn)用細(xì)胞類型、生長特性、病毒載體產(chǎn)量和穩(wěn)定性等存在較大差異，制備工藝成熟程度及病毒載體使用量等也不盡相同，建議結(jié)合待基因修飾細(xì)胞的特性、病毒載體的工藝和臨床使用需求等，合理確定病毒載體的制備規(guī)模。病毒載體制備規(guī)模需與細(xì)胞終產(chǎn)品研究階段（臨床試驗(yàn)、商業(yè)化制備）相適應(yīng)。工藝中可能包括生產(chǎn)用細(xì)胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或病毒感染、收獲、純化等步驟，制備過程中的上、下游工藝規(guī)模需盡量匹配且合理。對于較小的規(guī)模，建議關(guān)注不同批次間的質(zhì)量一致性。

       根據(jù)病毒載體工藝特點(diǎn)，制定批次定義和編號規(guī)則。如有需要，可明確制備過程中不同工藝步驟，特別關(guān)注如有分批和合批的操作步驟時(shí)的批次定義和編號規(guī)則。確保病毒載體批次的可追溯性。

       3.2 工藝研究與開發(fā)

       用于制備病毒載體的工藝有多種，包括通過質(zhì)粒 DNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞基質(zhì)制備，通過穩(wěn)定的生產(chǎn)用細(xì)胞系制備， 或通過病毒種子感染細(xì)胞基質(zhì)制備。

       鼓勵(lì)結(jié)合質(zhì)量源于設(shè)計(jì)和全過程控制等新理念，以及對 相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)控制的一般要求開展工藝研究。隨著生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)的積 累和質(zhì)量屬性認(rèn)識的加深，不斷優(yōu)化工藝，最終完成實(shí)驗(yàn)室 工藝到商業(yè)化規(guī)模工藝的轉(zhuǎn)化。制備工藝一般可以分為上游、下游兩個(gè)階段，即上游病毒載體收獲階段和下游病毒載體純 化階段。制備過程中的生產(chǎn)用細(xì)胞種類、細(xì)胞培養(yǎng)條件、轉(zhuǎn) 染或感染條件、收獲時(shí)間、純化步驟及貯存條件等均會(huì)影響 病毒載體的包裝效率和質(zhì)量。研究中需對工藝步驟、關(guān)鍵工藝參數(shù)及其控制范圍進(jìn)行研究、確認(rèn)或驗(yàn)證，并建立相應(yīng)的過程控制標(biāo)準(zhǔn)。例如，復(fù)制型病毒（Replication competent virus, RCV）是過程控制中的安全性風(fēng)險(xiǎn)關(guān)注點(diǎn)之一，應(yīng)根據(jù)病毒載體種類、工藝特點(diǎn)等開展風(fēng)險(xiǎn)評估，在制備過程中選擇合理的檢測點(diǎn)（如病毒載體收獲液、生產(chǎn)終末期細(xì)胞或純化后的病毒載體原液等），采用經(jīng)驗(yàn)證的方法開展檢測。另外，基于風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)合病毒對于理化條件的耐受性，必要時(shí)， 還需根據(jù)生產(chǎn)用細(xì)胞類型、輔助病毒使用、純化工藝特點(diǎn)等建立相應(yīng)的病毒去除/滅活步驟并進(jìn)行充分的驗(yàn)證。

       下文以 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體為例分別對穩(wěn)定產(chǎn)毒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種制備工藝進(jìn)行介紹。其他病毒載體和其他制備方式，如適用，也可參考。

       3.2.1 穩(wěn)定產(chǎn)毒制備工藝研究

       （1）制備

       以 γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為例，制備時(shí)其由穩(wěn)定產(chǎn)毒細(xì)胞分 泌至培養(yǎng)液中，可經(jīng)過澄清過濾等步驟純化獲得病毒載體。建議根據(jù)病毒載體的結(jié)構(gòu)特性、包裝機(jī)制、穩(wěn)定性等制定合 理的工藝步驟和參數(shù)，關(guān)注制備過程中的細(xì)胞培養(yǎng)體積、接 種密度、培養(yǎng)條件、收獲時(shí)間等。例如，有報(bào)道稱由于 γ- 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一些包膜蛋白在通常細(xì)胞培養(yǎng)條件（37℃） 下的穩(wěn)定性較弱，針對該情況建議開展研究，制定相應(yīng)的病 毒制備和收獲策略，以確保病毒載體的活性和回收率。

       （2）純化

       根據(jù) γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、宿主細(xì)胞的種類、雜質(zhì)殘留的成分等,設(shè)計(jì)合理的純化工藝，以提高病毒載體的純度，降低雜質(zhì)殘留的安全性風(fēng)險(xiǎn)。

       例如，某些病毒載體的包膜蛋白可能對層析工藝比較敏感（如剪切力），因此，鼓勵(lì)開發(fā)先進(jìn)的純化工藝，在滿足病毒載體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和功能活性的基礎(chǔ)上，盡可能提高病毒載體的純度，實(shí)現(xiàn)病毒載體的規(guī)?；兓?。

       3.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染制備工藝研究

       （1）包裝與制備

       以慢病毒載體為例，用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的病毒包裝細(xì)胞通常 采用貼壁或懸浮方式培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)方式建議根據(jù)規(guī)模、制 備工藝設(shè)計(jì)和質(zhì)量研究等選擇以滿足商業(yè)化制備的需求。病 毒包裝工藝的研究包括對質(zhì)粒濃度、質(zhì)粒比例、轉(zhuǎn)染試劑及 濃度、誘導(dǎo)試劑濃度（如有）、轉(zhuǎn)染時(shí)間、細(xì)胞密度、細(xì)胞 培養(yǎng)基組分、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境（溫度、pH、溶氧）、收獲時(shí)間、 收獲次數(shù)等參數(shù)的優(yōu)化。根據(jù)研究，確認(rèn)工藝步驟、關(guān)鍵工 藝參數(shù)及其控制范圍，并建立相應(yīng)的過程控制標(biāo)準(zhǔn)。例如在 細(xì)胞培養(yǎng)過程中定期檢測細(xì)胞活率和生物負(fù)荷，開展載體滴 度、支原體和外源性病毒等檢測，并進(jìn)行復(fù)制型慢病毒（RCL） 檢測等。載體收獲液如需貯存，需開展相應(yīng)的研究以確認(rèn)貯 存條件、貯存方式等。對于外源因子檢測，建議盡量提高檢測方法的靈敏度，在適宜的檢測點(diǎn)（如外源因子富集的階段） 進(jìn)行檢測。

       （2）純化

       目前，慢病毒載體的純化工藝通常采用核酸內(nèi)切酶去除附在病毒載體表面的大片段核酸雜質(zhì)，經(jīng)澄清、過濾及離子層析或分子排阻色譜等純化步驟進(jìn)行雜質(zhì)的去除，最后經(jīng)制劑、除菌過濾、灌裝制成病毒載體以備使用。根據(jù)研究，純化工藝可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和優(yōu)化，研究確定各純化工藝步驟以達(dá)到去除雜質(zhì)，純化病毒的目的。如適用，工藝研究中建議對核酸酶濃度、純化方式、介質(zhì)選擇、動(dòng)態(tài)載量、流速、回收率、病毒載體貯存條件、灌裝工藝參數(shù)等進(jìn)行研究，并對核酸酶殘留、BSA 殘留、風(fēng)險(xiǎn)元件殘留（如腺病毒 E1 和SV40LT 抗原序列殘留）、質(zhì)粒 DNA 殘留、宿主蛋白殘留、宿主 DNA 殘留及轉(zhuǎn)染試劑殘留等雜質(zhì)的去除率進(jìn)行研究。純化工藝過程中需加強(qiáng)過程控制檢測或質(zhì)量研究，如生物負(fù)荷、內(nèi)毒素、物理滴度、轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度等。

       3.3 工藝驗(yàn)證

       制備工藝鎖定后需開展工藝驗(yàn)證以對各步驟的工藝進(jìn)行確認(rèn)，如適用，可以包括細(xì)胞擴(kuò)增和載體制備各個(gè)步驟的驗(yàn)證、中間產(chǎn)物貯存條件和時(shí)間驗(yàn)證、雜質(zhì)清除驗(yàn)證、培養(yǎng)基模擬灌裝驗(yàn)證、層析柱和超濾膜循環(huán)使用次數(shù)和除菌濾器的驗(yàn)證以及運(yùn)輸驗(yàn)證等。通過工藝驗(yàn)證證明制備工藝及其在設(shè)定的工藝參數(shù)范圍內(nèi)可持續(xù)、穩(wěn)定的開展生產(chǎn)，病毒載體 的產(chǎn)量和回收率應(yīng)相對穩(wěn)定，對殘留的核酸酶、宿主細(xì)胞蛋 白、宿主細(xì)胞 DNA、質(zhì)粒 DNA、細(xì)胞碎片、轉(zhuǎn)染試劑等雜質(zhì)，應(yīng)有效清除至低于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍或經(jīng)過驗(yàn)證研究的水平。

       鼓勵(lì)建立上、下游規(guī)模匹配的制備工藝，如果在制備過程中出現(xiàn)合批和/或分批的情況，需結(jié)合實(shí)際制備情況進(jìn)行充分的研究驗(yàn)證，根據(jù)研究結(jié)果制定合批和/或分批的原則及具體操作規(guī)范。用于合批的樣品在合批前應(yīng)經(jīng)過檢驗(yàn)確認(rèn)為合格樣品。

       4. 質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

       4.1 質(zhì)量研究

       鼓勵(lì)運(yùn)用先進(jìn)的分析方法，多角度、多層面地開展質(zhì)量研究。分析方法需經(jīng)過研究和確認(rèn)，確保結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。一般建議采用多個(gè)代表性批次開展質(zhì)量研究，常見的研究項(xiàng)目包括外觀、病毒載體形態(tài)、鑒別、整合特征（如適用）、病毒載體滴度、生物學(xué)活性、純度、雜質(zhì)（如復(fù)制型病毒、風(fēng)險(xiǎn)元件殘留、外源因子）等。根據(jù)研究結(jié)果，確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

       4.1.1 鑒別與序列確認(rèn)

       可從病毒載體的整體水平、蛋白水平和核酸水平進(jìn)行檢測。整體水平方面，可采用電子顯微鏡觀察、免疫血清學(xué)等方法分析鑒別。蛋白水平方面，可采用蛋白質(zhì)電泳、免疫印跡等分析方法對載體的結(jié)構(gòu)蛋白、表達(dá)產(chǎn)物、蛋白表達(dá)譜、免疫標(biāo)記、表型特征等開展分析。核酸水平方面，建議對病毒載體進(jìn)行全基因組測序以確認(rèn)序列。需特別關(guān)注目的基因及調(diào)控元件序列的完整分析，對比分析測定序列與預(yù)期序列的一致性。對于整合型病毒載體，也可將病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞后，對整合有載體序列的細(xì)胞基因組進(jìn)行測序，驗(yàn)證載體骨架及目的基因序列的準(zhǔn)確性。另外，還可采用限制性酶切圖譜分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction， PCR）等方法對病毒載體和目的基因進(jìn)行鑒別。鑒別試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置合適的陽性和陰性對照。

       4.1.2 整合特征

       對于整合型病毒載體，建議選用適用的方法，研究載體整合至目的細(xì)胞基因組的典型特征，包括優(yōu)勢插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)、優(yōu)勢克隆異常生長等。關(guān)注是否存在病毒載體優(yōu)先整合至目的細(xì)胞基因組癌基因附近的情況及其他潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。

       4.1.3 病毒載體滴度

       滴度是病毒載體生物學(xué)活性和含量的重要檢測項(xiàng)目，可用于工藝過程監(jiān)控和放行檢測，需選擇靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度等符合要求的檢測方法開展研究。鼓勵(lì)采用多種方法進(jìn)行滴度的檢測，并探索不同方法檢測數(shù)值的相關(guān)性。滴度檢測包括物理滴度（病毒載體總顆粒數(shù)）和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度（病毒載體感染性顆粒數(shù)）。研究中需使用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌穪硇?zhǔn)滴度檢測結(jié)果?？梢酝ㄟ^病毒載體中感染性顆粒與總顆粒的比例，用于比較不同批次之間和載體制備的不同階段之間的質(zhì)量特征。

       物理滴度：載體特定蛋白/核酸的定量可用于載體顆粒數(shù)量（物理滴度）的估計(jì)。例如，HIV-1 衍生的慢病毒載體， 常用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測載體樣本中的 p24 蛋白從而進(jìn)行物理滴度的檢測，檢測結(jié)果可以 p24 蛋白含量/ml 或顆粒數(shù)/ml 表示，檢測時(shí)應(yīng)關(guān)注游離 p24 蛋白對結(jié)果的影響。此外，載體基因組拷貝數(shù)的定量也可用于物理滴度的估計(jì)，檢測時(shí)建議關(guān)注外源 DNA 的干擾。若采用新技術(shù)檢測，如病毒計(jì)數(shù)儀法、納米顆粒跟蹤分析法、場流分離- 多角度激光光散射法等，建議關(guān)注方法對待測病毒載體類型的適用性。

       轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度：可使用基于細(xì)胞的體外檢測方法檢測病毒載體的感染能力。通常待測病毒載體感染細(xì)胞一定時(shí)間后，通過細(xì)胞基因組定量 PCR、流式細(xì)胞術(shù)、組織/細(xì)胞病變或形成噬斑等方法檢測，計(jì)算出病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度，檢測結(jié)果通常以轉(zhuǎn)導(dǎo)單位（TU/ml）、半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）或噬斑形成單位（PFU）等表示。

       4.1.4 生物學(xué)活性

       一般指將目的基因轉(zhuǎn)移到目的細(xì)胞的能力以及目的基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)效應(yīng)，其中基因轉(zhuǎn)移能力也與病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度相關(guān)。生物學(xué)活性研究貫穿在整體研究開發(fā)過程中，建議在研發(fā)早期建立生物學(xué)活性檢測方法；上市階段， 建議根據(jù)載體的作用機(jī)制和質(zhì)量屬性，盡可能確定與實(shí)現(xiàn)預(yù)期功能（替代、補(bǔ)償、阻斷、修正特定基因作用等）相關(guān)的生物學(xué)活性檢測方法，必要時(shí)，建立合適的標(biāo)準(zhǔn)品。由于病毒載體的生物學(xué)活性發(fā)揮可能在細(xì)胞終產(chǎn)品中體現(xiàn)，因此， 也可以結(jié)合終產(chǎn)品的生物學(xué)活性綜合評價(jià)病毒載體的生物學(xué)活性。

       4.1.5 純度和雜質(zhì)

       （1） 載體相關(guān)雜質(zhì)：與病毒載體相關(guān)的典型雜質(zhì)可能包括錯(cuò)誤包裝顆粒、缺陷干擾顆粒、非感染性顆粒、空衣殼顆粒、聚集體或復(fù)制型病毒等，建議采用適用的方法，例如高效液相色譜、電泳法、毛細(xì)管電泳法、紫外吸收光譜法等進(jìn)行研究。通過病毒載體中總顆粒與感染性顆粒的比例，也可以反映病毒載體的純度和雜質(zhì)情況。另外，在核酸水平， 可以考慮鑒定具有缺失、重排、雜交或突變序列的載體等相關(guān)雜質(zhì)，以含量比率的形式報(bào)告檢測數(shù)值，必要時(shí)應(yīng)納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

       （2） 復(fù)制型病毒的檢測：采用復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型病毒載體時(shí)，需在工藝的適當(dāng)階段檢測制備過程中可能產(chǎn)生的具有復(fù)制能力的病毒，并根據(jù)細(xì)胞終產(chǎn)品給藥劑量、病毒載體風(fēng)險(xiǎn)等確定殘留量的標(biāo)準(zhǔn)限度。復(fù)制型病毒與產(chǎn)品的 安全性相關(guān)，需參考相關(guān)研究經(jīng)驗(yàn)或文獻(xiàn)，研究并建立靈敏 的檢測方法。常見的檢測方法包括指示細(xì)胞培養(yǎng)法、直接qPCR 法等。待測樣品包括病毒載體制備過程中收獲的病毒載體收獲液、生產(chǎn)終末細(xì)胞和細(xì)胞終產(chǎn)品等。方法開發(fā)時(shí)， 需關(guān)注各檢測方法對應(yīng)的操作流程、樣本量、陰性對照、陽 性對照、檢測標(biāo)志物、檢測限、判定標(biāo)準(zhǔn)等方面的設(shè)定和驗(yàn) 證研究。建議根據(jù)所用病毒包裝系統(tǒng)設(shè)計(jì)特異的檢測標(biāo)志物， 如適用，研究中鼓勵(lì)同時(shí)采取兩種以上基于不同原理或針對 不同標(biāo)志物的檢測方法，從而提高復(fù)制型病毒的檢出率。當(dāng) 采用指示細(xì)胞培養(yǎng)法時(shí)，需選擇合理的擴(kuò)增細(xì)胞和指示細(xì)胞， 并應(yīng)考慮待檢樣本對指示細(xì)胞生長的抑制作用等，研究、設(shè) 置合理的待測樣本滴度范圍，并建議設(shè)置干擾組對照。

       復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒（RCR）檢測：根據(jù)目前的研究技術(shù)水平，建議采用敏感的指示細(xì)胞培養(yǎng)法對γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行 RCR 檢測。RCR 擴(kuò)增細(xì)胞與待測樣本進(jìn)行共培養(yǎng)以最 大 程 度擴(kuò)增 RCR，在一定傳代次數(shù)和時(shí)間的傳代培養(yǎng)后取適量上清接種 RCR 指示細(xì)胞培養(yǎng)，以觀察、計(jì)數(shù)細(xì)胞病變集落或者進(jìn)行 RCR 標(biāo)志物的檢測。

       復(fù)制型慢病毒（RCL）檢測：根據(jù)目前的研究技術(shù)水平，建議采用指示細(xì)胞培養(yǎng)法對慢病毒載體進(jìn)行 RCL 檢測。對于 HIV 衍生的慢病毒載體，其 RCL 檢測所用陽性對照可考慮使用滿足檢測要求的 HIV 病毒，如缺乏輔助基因的，同時(shí)具有復(fù)制能力的病毒，研究并評估陽性對照病毒的結(jié)構(gòu)和制備方法，并在符合要求的環(huán)境中妥善操作和使用。RCL 檢測指標(biāo)方面，通常認(rèn)為 p24 蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶活性、psi-gag 和 VSV-G 序列等的檢出可反映 RCL 的存在，結(jié)合病毒載體具體情況和研究情況，選擇合適的檢測指標(biāo)。

       （3） 工藝相關(guān)雜質(zhì)：可能包括殘留宿主細(xì)胞蛋白、非目的核酸序列、輔助病毒污染物（如傳染性病毒、病毒 DNA、病毒蛋白等）和工藝中所使用的試劑殘留，例如細(xì)胞因子、生長因子、抗體、轉(zhuǎn)染試劑、磁珠、核酸酶、血清和溶劑等。

       以非目的 DNA 殘留為例，其可能包括與病毒載體共純化的殘留宿主 DNA、質(zhì)粒 DNA 等，是常見的工藝相關(guān)雜質(zhì)。包裝過程中病毒載體的衣殼內(nèi)部也可能共包裝非目的 DNA， 這些雜質(zhì)可能對產(chǎn)品質(zhì)量和安全性產(chǎn)生不利影響，建議優(yōu)化 工藝，以減少其污染。必要時(shí)，對殘留的非目的 DNA 序列進(jìn)行確認(rèn)和含量的監(jiān)測。當(dāng)生產(chǎn)/包裝細(xì)胞為腫瘤來源的細(xì) 胞、致瘤細(xì)胞系或攜帶有致癌基因序列等需要高度關(guān)注的細(xì) 胞時(shí)，在優(yōu)化工藝、降低其殘留的基礎(chǔ)上，還建議控制非目的 DNA 片段大小（建議在 200bp 以下），并對已知的高風(fēng) 險(xiǎn)基因進(jìn)行專項(xiàng)監(jiān)測。例如，采用HEK293T 細(xì)胞進(jìn)行慢病毒載體制備時(shí)，需采用具有足夠的靈敏度和特異性的方法檢 測腺病毒 E1 和 SV40LT 抗原序列的殘留。

       4.1.6 其他

       微生物污染物：檢測可能引入的污染物，包括外源病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、細(xì)菌內(nèi)毒素等。

       理化檢測：常規(guī)的理化檢測項(xiàng)目可能包括外觀（顏色、透明度）、可見異物、不溶性微粒、pH、含量、滲透壓等。

       4.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

       質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是質(zhì)量控制的重要部分，包括檢測項(xiàng)目、檢測用方法學(xué)和各檢測指標(biāo)的可接受標(biāo)準(zhǔn)。檢測階段一般包括放行檢測和/或過程控制等。

       根據(jù)現(xiàn)有研究認(rèn)知，病毒載體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測項(xiàng)目通常包括外觀、鑒別、純度、含量/滴度、生物學(xué)活性、雜質(zhì)、無菌性、細(xì)菌內(nèi)毒素、支原體和外源病毒因子等。檢測用方法需經(jīng)過研究與驗(yàn)證以確保檢測結(jié)果可靠和準(zhǔn)確。如適用， 盡量建立對照品/標(biāo)準(zhǔn)品，并對其開展相應(yīng)的質(zhì)量研究、含量/活性的標(biāo)定、確定貯存條件等。一般情況下，可接受標(biāo)準(zhǔn)的制定依據(jù)包括產(chǎn)品質(zhì)量設(shè)計(jì)、質(zhì)量研究、工藝開發(fā)、驗(yàn)證研究、方法學(xué)研究與驗(yàn)證、多批檢測和穩(wěn)定性結(jié)果，以及合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法等。

       （二）非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)

       非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)可通過物理、化學(xué)或生物轉(zhuǎn)導(dǎo)方式遞送進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入目的細(xì)胞后，通過轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯等方式發(fā)揮作用，其活性組分為DNA、RNA 或蛋白質(zhì)，也可能為核酸與蛋白質(zhì)組分的組合。

       1. 分子設(shè)計(jì)

       非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)的設(shè)計(jì)影響目的基因修飾或目的基因表達(dá)的特異性、準(zhǔn)確性和有效性，也影響基因修飾細(xì)胞終產(chǎn)品的安全性和有效性，構(gòu)建時(shí)需要對設(shè)計(jì)和改構(gòu)的利弊進(jìn)行權(quán)衡分析。

       對于 DNA 類基因修飾系統(tǒng)，開發(fā)過程中需關(guān)注基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在目的細(xì)胞中的整合位點(diǎn)及拷貝數(shù)等。采用的設(shè)計(jì)策略包括基因密碼子優(yōu)化、染色體同源序列的改構(gòu)、富含 GC 區(qū)序列的改構(gòu)、信號肽以及合理啟動(dòng)子的應(yīng)用等。目前體外基因修飾常用的環(huán)狀DNA 類基因修飾系統(tǒng)，包括質(zhì)粒、微環(huán)（Minicircle）DNA、納米質(zhì)粒（Nanoplasmid）等不同類型。不同類型環(huán)狀 DNA 的選擇可重點(diǎn)關(guān)注高純度載體制備的難易程度、載體重組、細(xì)菌來源 DNA 序列在目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的表觀遺傳修飾對目的基因表達(dá)的影響等。此外，環(huán)狀 DNA 類基因修飾系統(tǒng)內(nèi)可引入特殊的 DNA 片段，形成游離型載體，如引入 EBV 來源的順式作用 DNA 片段OriP 和反式作用的EBNA1 基因的載體，此類載體需關(guān)注種屬、細(xì)胞類型對游離型載體功能的影響，載體重組、順式/反式作用 DNA 片段對目的基因表達(dá)的影響等。

       對于 RNA 類基因修飾系統(tǒng)，以 mRNA 為例，根據(jù)目前的研究進(jìn)展，考慮到設(shè)計(jì)對 RNA 的穩(wěn)定性和其在目的細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)活性等可能具有顯著影響，構(gòu)建時(shí)可以關(guān)注堿基修飾類型和比例、5’-帽或帽類似物結(jié)構(gòu)、非翻譯區(qū)序列、Poly（A）加尾結(jié)構(gòu)和自擴(kuò)增元件（如有）等，并同時(shí)進(jìn)行密碼子優(yōu)化、調(diào)控堿基間作用力及高級結(jié)構(gòu)等方面的改造， 以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的功能。

       對于基因編輯系統(tǒng)，建議對靶向序列、目的基因序列（如有）和基因編輯用酶等的序列和比例等進(jìn)行優(yōu)化。通過特定細(xì)胞中的基因編輯效果確認(rèn)基因編輯用酶和靶向序列的特異性，篩選最 佳的靶向結(jié)合序列（如 sgRNA 序列），并采取措施降低基因脫靶、插入突變的概率及對目的細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的不良影響。對于轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，建議考慮整合位點(diǎn)的特異性和分布趨勢， 以及轉(zhuǎn)座子在基因組中的移動(dòng) （genomicmobilization）等特征，進(jìn)行轉(zhuǎn)座子序列、轉(zhuǎn)座酶及相應(yīng)調(diào)控元件的優(yōu)化，合理設(shè)置轉(zhuǎn)座序列/轉(zhuǎn)座酶的比例、序列分布等。

       2. 生產(chǎn)用物料

       基本原則可參考病毒載體類基因修飾系統(tǒng)部分的相關(guān)要求。

       對于采用重組技術(shù)或生物/化學(xué)合成技術(shù)制備的生產(chǎn)用原材料，需明確工藝和質(zhì)量控制情況，特別是需要分析生產(chǎn)過程中可能引入的安全性相關(guān)雜質(zhì)。對于制備過程中使用的酶類試劑，建議重點(diǎn)關(guān)注酶的功能活性，例如需關(guān)注所用DNA 聚合酶、RNA 聚合酶的保真度和活性，消化酶的酶解作用、酶的非特異性消化條件等，同時(shí)需要關(guān)注酶的純度、生產(chǎn)過程中引入的雜質(zhì)等。對于核苷酸、5’-帽或帽類似物等原材料，其整體的質(zhì)量應(yīng)符合制備的要求，建議關(guān)注鑒別、濃度、純度和雜質(zhì)等。制備過程建議避免使用氯化銫、溴化乙錠、氯仿等**物質(zhì)，避免使用動(dòng)物源胰蛋白胨、核酸酶等可能引入外源因子等風(fēng)險(xiǎn)的原材料。

       對于用作遞送系統(tǒng)的材料，其制備涉及的關(guān)鍵原材料（脂質(zhì)、陽離子聚合物等）需進(jìn)行充分的篩選和質(zhì)量控制。

       3. 制備工藝

       基本要求同病毒載體類基因修飾系統(tǒng)。對于體外基因修飾后直接制備細(xì)胞產(chǎn)品的情況，需要多次、規(guī)模化的制備， 具體情況介紹如下。

       3.1 DNA 類基因修飾系統(tǒng)

       以質(zhì)粒 DNA 為例，其制備步驟一般包括微生物培養(yǎng)及發(fā)酵、菌體收集、菌體裂解、質(zhì)粒純化、濃縮、灌裝等。工藝研究與確定過程需對關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行探索和優(yōu)化，建立穩(wěn)定的制備工藝。關(guān)鍵工藝參數(shù)可能包括發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、補(bǔ)料培養(yǎng)基組成、補(bǔ)料時(shí)間和補(bǔ)料量、溶氧量、堿裂解緩沖液及中和緩沖液的組成、堿裂解時(shí)間、層析柱載量、層析流速等。研究中建議關(guān)注制備全過程對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和功能可能的影響，如堿裂解步驟可能產(chǎn)生的質(zhì)粒不可逆變性的情況等。純化工藝開發(fā)過程中，可以根據(jù)質(zhì)粒的實(shí)際大小和性質(zhì)選擇合適的柱層析填料，最 大 程 度去除宿主RNA、宿主 DNA、DNA 碎片和細(xì)菌內(nèi)毒素等雜質(zhì)。根據(jù)研究，設(shè)置合理的過程控制指標(biāo)和可接受標(biāo)準(zhǔn)，如質(zhì)粒中間產(chǎn)物的濃度、超螺旋比例、雜質(zhì)殘留量等。

       3.2 RNA 類基因修飾系統(tǒng)

       基于研究現(xiàn)狀，RNA 的制備一般包括體外化學(xué)合成和DNA 轉(zhuǎn)錄兩種工藝路線。體外化學(xué)合成工藝請參考化學(xué)藥物的相關(guān)技術(shù)指南。DNA 轉(zhuǎn)錄工藝路線以 mRNA 的制備工藝為例，該工藝一般采用 DNA 轉(zhuǎn)錄模板進(jìn)行 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄、mRNA 加帽、去磷酸化、DNA 酶處理、mRNA 純化等步驟。建議對工藝參數(shù)進(jìn)行研究與優(yōu)化，開發(fā)穩(wěn)健的工藝， 確保 mRNA 序列正確性、結(jié)構(gòu)完整性、生物學(xué)活性和不同批次間質(zhì)量的一致性。對工藝中引入的潛在雜質(zhì)進(jìn)行研究， 明確雜質(zhì)的來源、去除步驟和去除能力等。工藝研究中需對關(guān)鍵工藝參數(shù)及控制范圍進(jìn)行確認(rèn)，如 NTP 濃度、轉(zhuǎn)錄時(shí)間、反應(yīng)溫度、加帽反應(yīng)物料投料比、層析介質(zhì)、動(dòng)態(tài)載量等，關(guān)注產(chǎn)品回收率、雜質(zhì)去除率、加帽率、poly（A）長度及分布（如適用）、mRNA 片段的完整性以及序列的準(zhǔn)確性等方面。制備過程中需設(shè)置合理的過程控制指標(biāo)，如mRNA 濃度、雙鏈 mRNA 含量、不完整 mRNA 含量、殘留DNA、無菌、細(xì)菌內(nèi)毒素等。

       3.3 其他

       基因修飾系統(tǒng)如含有重組蛋白質(zhì)成分，根據(jù)具體情況， 可以參考重組蛋白質(zhì)類生物制品生產(chǎn)的相關(guān)技術(shù)要求。

       4. 質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

       4.1 質(zhì)量研究

       質(zhì)量研究通常包括鑒別、結(jié)構(gòu)特征、理化特性、生物學(xué)活性、純度和雜質(zhì)分析等。研究中建議采用多個(gè)代表性批次開展研究。如含有化學(xué)合成的組分和/或重組蛋白組分的， 可參考相關(guān)指導(dǎo)原則等開展質(zhì)量研究。

       鑒別和序列確認(rèn)：鑒別研究中，可采用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，觀察是否存在特征性的帶型；也可以用 PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，分析片段大小是否與理論大小一致等方法。對于 RNA，可將其逆轉(zhuǎn)錄為 DNA 后，采用上述方法進(jìn)行鑒別，或考慮采用其他適用的方法。序列確認(rèn)研究中，建議開展全序列測定，重點(diǎn)關(guān)注目的基因和調(diào)控元件的序列正確性，對于 RNA, 如有，建議同時(shí)關(guān)注 poly（A）序列的正確性。

       結(jié)構(gòu)：建議采用適用的方法對結(jié)構(gòu)完整性和大小均一性進(jìn)行研究。如對于 DNA，可關(guān)注其是否存在單鏈、雙鏈、線性/開環(huán)、環(huán)狀和超螺旋等多種結(jié)構(gòu)形式，以及可能的高級結(jié)構(gòu)等；對于 mRNA，可關(guān)注其不同區(qū)域結(jié)構(gòu)的完整性（如 5’-帽或帽類似物結(jié)構(gòu)、poly（A）長度）、堿基修飾結(jié)構(gòu)、去磷酸化程度以及可能的高級結(jié)構(gòu)（如莖環(huán)結(jié)構(gòu)）等。若功能活性與高級結(jié)構(gòu)相關(guān)，建議分析研究高級結(jié)構(gòu)特征。對于復(fù)合核酸類基因修飾系統(tǒng)，建議開展結(jié)構(gòu)分析，如關(guān)注復(fù)合結(jié)構(gòu)的粒徑大小、粒度分布、顆粒聚集等。

       理化特性：建議開展分子量、核酸濃度/含量、修飾位點(diǎn)及比例（如有）、物理特性（如 pH、滲透壓）等方面的研究。

       生物學(xué)活性：根據(jù)作用機(jī)制，生物學(xué)活性研究通常包括對基因修飾效率、目的基因表達(dá)的水平、表達(dá)產(chǎn)物的功能或體外模擬生理功能的測定等。建議首選定量檢測方法，如可通過目的基因或基因編輯產(chǎn)物的表達(dá)量和功能進(jìn)行分析，關(guān)注表達(dá)產(chǎn)物是否與預(yù)計(jì)一致或蛋白表達(dá)/基因是否被抑制、空間結(jié)構(gòu)是否符合設(shè)計(jì)（如多聚體）等。當(dāng)采用體外轉(zhuǎn)染檢測細(xì)胞的方法時(shí)，需關(guān)注選擇的檢測細(xì)胞是否具有代表性和合理性。

       純度：可以采用瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等方法開展純度的研究。對于復(fù)合核酸類基因修飾系統(tǒng)，建議關(guān)注包封率、游離核酸含量等。

       雜質(zhì)：一方面，雜質(zhì)可能來自原材料、制備過程、制備 和貯存過程中直接接觸容器和材料的溶解物。如 DNA 模板、酶類試劑、磁珠等原材料和添加的成分；乙醇、異丙醇等有機(jī)溶劑；宿主蛋白殘留、宿主 DNA 殘留、宿主 RNA 殘留等。另一方面，與基因修飾系統(tǒng)相關(guān)的雜質(zhì)，可能包括缺失、重排、雜交或突變序列等相關(guān)雜質(zhì)，建議進(jìn)行定性和定量的相關(guān)研究。對于 DNA 類基因修飾系統(tǒng)，相關(guān)研究可以包括開環(huán)/線性 DNA 含量、過度甲基化修飾的分子等。對于mRNA 類基因修飾系統(tǒng)，相關(guān)研究可以包括降解/斷裂產(chǎn)生的 RNA 片段、加帽不完全的 mRNA、修飾過度的 RNA、RNA 錯(cuò)配序列、RNA 氧化產(chǎn)物等。結(jié)合制備工藝的雜質(zhì)清除能力，采用適用的方法對雜質(zhì)的殘留水平進(jìn)行分析，評估相關(guān)安全性風(fēng)險(xiǎn)。

       微生物安全性：可結(jié)合工藝過程，檢測可能引入的污染物，包括細(xì)菌、真菌、支原體（如適用）、細(xì)菌內(nèi)毒素等。

       其他特性研究：對于使用基因編輯工具酶的修飾系統(tǒng)， 質(zhì)量研究中建議持續(xù)關(guān)注對應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)品中修飾系統(tǒng)的殘留 情況，采用生物信息學(xué)工具分析靶細(xì)胞基因組結(jié)構(gòu)變化、單點(diǎn)和小規(guī)?；蛲蛔円约巴庠碊NA 在基因組中的插入位置、拷貝數(shù)等，監(jiān)控基因編輯用酶的細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)時(shí)間，考察脫靶效應(yīng)及相應(yīng)的安全性影響等。

       4.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

       根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)分析，結(jié)合工藝研究與驗(yàn)證、臨床試驗(yàn)及商業(yè)化批次質(zhì)量分析、穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)等制定合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 明確各檢測項(xiàng)對應(yīng)的分析方法、標(biāo)準(zhǔn)限度范圍并建立標(biāo)準(zhǔn)品/參考品等。對于一般工藝相關(guān)雜質(zhì)，如經(jīng)充分驗(yàn)證證明工藝可對其有效、穩(wěn)定地清除，可結(jié)合工藝進(jìn)行控制，相關(guān)殘留檢測可考慮不列于檢定項(xiàng)目中。

       質(zhì)量控制項(xiàng)目可以包括理化性質(zhì)、純度和雜質(zhì)、生物學(xué)活性、微生物安全性等。其中，DNA 類的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以納入外觀、pH 值、含量、鑒別、序列分析、純度、超螺旋比例、生物學(xué)活性、無菌檢測、細(xì)菌內(nèi)毒素、雜質(zhì)殘留等檢測項(xiàng)目。mRNA 類的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以納入外觀、pH 值、含量、鑒別、序列分析、mRNA 完整性、加帽率、poly（A）長度及分布、生物學(xué)活性、無菌檢測、細(xì)菌內(nèi)毒素、雙鏈 RNA 殘留、溶劑殘留等檢測項(xiàng)目。常見的復(fù)合核酸類基因修飾系統(tǒng)的質(zhì)量控制項(xiàng)目包括外觀、pH、顆粒大小及分散系數(shù)、滲透壓、鑒別、序列測定、含量/濃度檢測、生物學(xué)活性、純度、序列完整性、包封率、復(fù)合材料各組分含量（例如脂質(zhì)鑒別和含量）、游離核酸、可見異物、雜質(zhì)、微生物安全性等。

       方法學(xué)研究與驗(yàn)證方面，基本原則同病毒載體類基因修飾系統(tǒng)的要求。

       六、穩(wěn)定性研究與直接接觸性容器/材料研究

       （一）穩(wěn)定性研究

       基因修飾系統(tǒng)如涉及到貯存，則需開展相應(yīng)的穩(wěn)定性研究。采用擬貯存階段樣品的代表性批次開展研究，一般包括貯存、運(yùn)輸（如適用）和使用穩(wěn)定性研究等。研究開展前， 需統(tǒng)籌制定穩(wěn)定性研究方案，關(guān)注各穩(wěn)定性研究所用樣品、直接接觸性容器/材料、檢測時(shí)間點(diǎn)、檢測條件和分析檢項(xiàng)等。

       研究中需對能夠反映質(zhì)量變化的敏感特征進(jìn)行研究，如 含量、完整性、純度、微生物安全性和生物學(xué)活性等。研究 中需涵蓋擬定的各項(xiàng)條件，如溫度、光照、反復(fù)凍融（冷凍 貯存時(shí)）、振搖等方面。根據(jù)實(shí)際使用情況，開展使用中穩(wěn) 定性研究，例如復(fù)溶或解凍，與復(fù)溶稀釋劑的相容性等研究。研究中需采用與實(shí)際使用相同材質(zhì)的直接接觸性容器/材料。

       對于病毒載體類基因修飾系統(tǒng)，穩(wěn)定性研究中建議重點(diǎn) 考察病毒載體的滴度、純度、雜質(zhì)、微生物安全性指標(biāo)、生 物學(xué)活性等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。對于非病毒載體類基因修飾系統(tǒng)， 建議重點(diǎn)關(guān)注理化特性、結(jié)構(gòu)完整性、雜質(zhì)等關(guān)鍵質(zhì)量屬性。例如，DNA 超螺旋結(jié)構(gòu)的比例可能影響 DNA 的轉(zhuǎn)染率， mRNA 加帽率可能影響 mRNA 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和翻譯效率， 建議在穩(wěn)定性研究中重點(diǎn)考察。

       （二）直接接觸性容器/材料研究

       如涉及貯存，需對直接接觸的包裝容器開展相應(yīng)的包材相容性研究。根據(jù)相容性研究結(jié)果，結(jié)合穩(wěn)定性研究，選擇合理的包裝容器。

       另外，對制備工藝中與樣品接觸的容器和一次性使用材料（如貯存袋、過濾膜、層析介質(zhì)、管路等），需開展風(fēng)險(xiǎn)評估和/或相應(yīng)的相容性研究。

       七、參考文獻(xiàn)

       [1] U.S.FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) information for human gene therapy Investigational New Drug applications (INDs). 2020.

       [2] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行). 2017.

       [3] EMA. Guideline on development and manufacture of lentiviral vectors. 2005.

       [4] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.生物制品穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）. 2015.

       [5] EMA. Quality, preclinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. 2018.

       [6] ICH. Q5A Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell lines of human or animal origin. 1999.

       [7] ICH. Q5C Stability testing of biotechnological and biological products. 1995.

       [8] ICH. Q5D Derivation and characterization of cell substrates used for production of biotechnological/biological products. 1997.

       [9] U.S. FDA. Testing of retroviral vector-based human genetherapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. 2020.

       [10] EMA. Guideline on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells. 2020.

       《免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》

       一、前言

       近年來，生物技術(shù)發(fā)展迅速，促進(jìn)了免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的研發(fā)，為一些嚴(yán)重及難治性疾病提供了新的治療手段。2017 年，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，該指導(dǎo)原則對按照藥品進(jìn)行研究和申報(bào)的細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)技術(shù)要求進(jìn)行了總體闡述。由于不同免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的細(xì)胞來源、類型、體外操作等方面差異較大，質(zhì)量研究和質(zhì)量控制相較傳統(tǒng)藥物更加復(fù)雜，為規(guī)范和指導(dǎo)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品按照藥品管理規(guī)范進(jìn)行研發(fā)和評價(jià)，制定本指導(dǎo)原則。

       本指導(dǎo)原則僅基于當(dāng)前的科學(xué)認(rèn)知，對免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的藥學(xué)研究提出一般性技術(shù)原則和建議，內(nèi)容不具有強(qiáng)制性。申請人/持有人也可基于產(chǎn)品具體情況采用其他有效的方法開展研究，并說明合理性。隨著技術(shù)的發(fā)展、認(rèn)知的深入和經(jīng)驗(yàn)的積累，將逐步修訂和完善相關(guān)產(chǎn)品的技術(shù)要求。

       二、適用范圍

       本指導(dǎo)原則中免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品是指源自人體（自體/異體）細(xì)胞或人源細(xì)胞系的細(xì)胞，經(jīng)過體外操作，包括但不限于分離、純化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化、活化、遺傳修飾、細(xì)胞庫（系）的建立、凍存復(fù)蘇等，再輸入或植入到患者體內(nèi)，通過誘導(dǎo)、增強(qiáng)或抑制機(jī)體的免疫功能而治療疾病的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品， 例如嵌合抗原受體 T 細(xì)胞（ ChimericAntigen Receptor T-Cell，CAR-T）、樹突狀細(xì)胞（Dendritic Cell，DC）等。

       胰島細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等體細(xì)胞，以及細(xì)胞與非細(xì)胞成分的組合產(chǎn)品的細(xì)胞部分也可以參考本指導(dǎo)原則。細(xì)胞衍生產(chǎn)品，如細(xì)胞外泌體、細(xì)胞裂解物、滅活細(xì)胞等產(chǎn)品，其細(xì)胞部分的藥學(xué)研究也可能適用。對于經(jīng)基因修飾的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品（如 CAR-T 等），其細(xì)胞部分可以參考本指導(dǎo)原則， 基因修飾部分可以參考其他相關(guān)技術(shù)指南。本指導(dǎo)原則不適用于干細(xì)胞、輸血或移植用的造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞，以及由細(xì)胞組成的類組織、類器官產(chǎn)品等。

       本指導(dǎo)原則適用于按照藥品管理相關(guān)法規(guī)進(jìn)行研發(fā)和注冊申報(bào)的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品，主要適用于上市申請階段的藥學(xué)研究。

       三、一般原則

       按照藥品研發(fā)和申報(bào)的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品應(yīng)符合《中華人民共和國藥品管理法》、《藥品注冊管理辦法》、《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）等相關(guān)法律法規(guī)的要求。免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)過程應(yīng)當(dāng)符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（簡稱 GMP）的基本原則和相關(guān)要求。生物安全性方面，應(yīng)符合國家相關(guān)法律法規(guī)要求。人體組織、細(xì)胞、基因的來源和處理應(yīng)符合國家人類遺傳資源管理的相關(guān)法律法規(guī)要求。

       （一）研究開發(fā)規(guī)律

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的藥學(xué)研究遵循藥品研發(fā)的一般規(guī)律，貫穿產(chǎn)品的整個(gè)生命周期。該類產(chǎn)品個(gè)性化較強(qiáng)、工藝復(fù)雜多樣、對環(huán)境敏感、非冷凍狀態(tài)下有效期較短，同時(shí)細(xì)胞本身具備體內(nèi)生存、自主增殖和/或分化、細(xì)胞間相互作用等能力，其藥學(xué)研究應(yīng)充分考慮產(chǎn)品的以上基本特征和特殊性，在符合不同階段技術(shù)要求的同時(shí)，藥學(xué)研究需要不斷優(yōu)化和完善，提高產(chǎn)品的質(zhì)量。

       1. 申報(bào)臨床試驗(yàn)階段

       申報(bào)臨床試驗(yàn)階段的藥學(xué)技術(shù)要求需結(jié)合產(chǎn)品的自身特點(diǎn)和生產(chǎn)工藝具體情況進(jìn)行整體的評價(jià)與判斷。為了保障受試者的安全，臨床試驗(yàn)申請通常重點(diǎn)關(guān)注與安全性相關(guān)的方面，例如生產(chǎn)用原材料的質(zhì)量控制、降低混淆/污染/交叉污染風(fēng)險(xiǎn)的措施、工藝穩(wěn)定性、與安全性相關(guān)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性、非臨床研究樣品/非注冊臨床研究樣品（如適用）與臨床試驗(yàn)樣品的質(zhì)量可比性等。另外，臨床試驗(yàn)樣品的生產(chǎn)條件應(yīng)符合 GMP 的基本原則。

       一般情況下，申報(bào)臨床試驗(yàn)時(shí)需要完成以下研究：對生產(chǎn)過程中使用的原材料和輔料，尤其是人源/動(dòng)物源性材料， 開展充分的安全性分析，評估使用的必要性和合理性。生產(chǎn)工藝需經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室工藝至臨床試驗(yàn)用工藝的轉(zhuǎn)化研究評估， 確定與臨床試驗(yàn)階段相適應(yīng)的細(xì)胞生產(chǎn)工藝的步驟、參數(shù)，以及生產(chǎn)過程控制措施等，支持工藝的合理性和穩(wěn)定性，能夠滿足臨床試驗(yàn)用樣品的產(chǎn)能需求，保證產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量可控性。完成安全性相關(guān)的質(zhì)量研究，例如外源因子、雜質(zhì)等，并完成相關(guān)方法學(xué)確認(rèn)。質(zhì)量控制方面，設(shè)定與臨床試驗(yàn)階段相適應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，安全性相關(guān)的質(zhì)量控制可結(jié)合質(zhì)量研究并可參考同類產(chǎn)品的已有安全性標(biāo)準(zhǔn)或共識標(biāo)準(zhǔn)。另外，需要比較分析非臨床研究、非注冊臨床試驗(yàn)（如適用） 與臨床試驗(yàn)的生產(chǎn)工藝（廣義的包括原材料、場地、生產(chǎn)工藝、規(guī)模等）和樣品質(zhì)量的異同，必要時(shí)，進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估和深入的研究。申報(bào)臨床試驗(yàn)階段，貯存、運(yùn)輸和使用的穩(wěn)定性研究條件應(yīng)具有代表性，穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)應(yīng)能支持臨床樣品的實(shí)際貯存等條件。直接接觸樣品的材料需經(jīng)過安全性和適用性的評估。

       2. 申報(bào)上市階段

       在充分的工藝開發(fā)和研究基礎(chǔ)上，建立成熟穩(wěn)定的商業(yè)化生產(chǎn)工藝，能持續(xù)穩(wěn)定地生產(chǎn)出安全、有效、質(zhì)量可控的產(chǎn)品。商業(yè)化生產(chǎn)工藝應(yīng)經(jīng)過全面的工藝驗(yàn)證，嚴(yán)格控制生產(chǎn)用材料的質(zhì)量，明確關(guān)鍵生產(chǎn)步驟、關(guān)鍵工藝參數(shù)范圍、關(guān)鍵過程控制項(xiàng)目和可接受標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過充分的質(zhì)量研究、方法學(xué)驗(yàn)證和穩(wěn)定性研究，建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)規(guī)范的穩(wěn)定性研究和包材相容性研究，制定產(chǎn)品有效期，明確運(yùn)輸、使用過程中的條件和時(shí)長，以及確定合適的包裝容器/材料。

       3. 工藝變更

       鼓勵(lì)申請人/持有人不斷改進(jìn)和優(yōu)化生產(chǎn)工藝，持續(xù)提高產(chǎn)品質(zhì)量。如發(fā)生工藝變更，應(yīng)根據(jù)變更情況開展相應(yīng)的可比性研究，分析變更前、后產(chǎn)品質(zhì)量的可比性，以證明變更不對產(chǎn)品的安全性、有效性和質(zhì)量可控性產(chǎn)生不良影響。

       （二）產(chǎn)品特點(diǎn)相關(guān)技術(shù)考量

       1. 生產(chǎn)用原材料

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)用原材料來源多樣且存在不同程度的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)按照《中國藥典》的相關(guān)要求進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估和質(zhì)量控制，建立良好、規(guī)范的生產(chǎn)用原材料的質(zhì)量管理體系。優(yōu)先選用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)級別高的或風(fēng)險(xiǎn)級別低的原材料，對人源/動(dòng)物源性原材料進(jìn)行生物安全性評估和控制，降低外源因子的引入或傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)用細(xì)胞可為自體來源、同種異體來源、人源細(xì)胞系來源等。涉及細(xì)胞/組織采集時(shí)需建立合理明確的醫(yī)療機(jī)構(gòu)質(zhì)量評估內(nèi)容、審核和篩選的原則及標(biāo)準(zhǔn)。建議申請人/持有人對合作醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行質(zhì)量評估、審核和篩選，通過建立和使用采集操作文件等方式確保采集過程的規(guī)范性。另外，結(jié)合質(zhì)量研究情況，需建立供者篩查標(biāo)準(zhǔn)和制定采集細(xì)胞/組織的質(zhì)量要求，并對采集后細(xì)胞/組織的保存、運(yùn)輸和入廠檢驗(yàn)等過程建立明確的操作規(guī)范。

       2. 生產(chǎn)工藝

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)工藝復(fù)雜，無病毒清除、終端滅菌步驟，其生產(chǎn)應(yīng)遵循 GMP 的原則和要求，生產(chǎn)工藝經(jīng)過驗(yàn)證并建立清晰的過程控制。應(yīng)特別關(guān)注人員、廠房與設(shè)備、原材料控制、環(huán)境與設(shè)施等。生產(chǎn)廠房的總體分區(qū)布局應(yīng)合理，各區(qū)根據(jù)工藝步驟及相應(yīng)的潔凈度級別應(yīng)合理設(shè)計(jì)、布局及運(yùn)維，能符合免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的質(zhì)量管理要求， 建議盡量采用自動(dòng)化的、連續(xù)的、封閉或半封閉的生產(chǎn)設(shè)備， 使用專用的、產(chǎn)品特定的、可以滿足控制污染風(fēng)險(xiǎn)的裝置， 最大限度降低微生物、各種微粒的污染風(fēng)險(xiǎn)。建立開場和清場制度，建立全過程控制體系，避免生產(chǎn)用原材料和生產(chǎn)操作過程中可能引入的外源性污染或交叉污染。生產(chǎn)過程中， 應(yīng)注意不同供者批次細(xì)胞的操作時(shí)間和空間隔離，避免不同批次樣品的混淆、交叉污染。建立產(chǎn)品可追溯的管理體系， 以確保產(chǎn)品從供者到受者全過程的可追溯性。

       3. 質(zhì)量控制

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制策略包括物料質(zhì)量控制、生產(chǎn)工藝過程控制、中間樣品質(zhì)量檢驗(yàn)、終產(chǎn)品放行檢驗(yàn)以及留樣檢驗(yàn)等。原則上，每批產(chǎn)品均需通過質(zhì)量控制并檢驗(yàn)合格后放行。但是，考慮到免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的特殊性，在最 大 程 度控制風(fēng)險(xiǎn)的前提下，可結(jié)合臨床使用緊急程度、產(chǎn)品貯存和運(yùn)輸?shù)姆绞?時(shí)間等，制定合理、靈活的質(zhì)量控制策略。

       4. 貯存和運(yùn)輸

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的貯存和運(yùn)輸過程可能涉及到冷凍或冷藏，貯存和運(yùn)輸?shù)臈l件、時(shí)間，以及相應(yīng)的包裝等應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證。對于冷凍產(chǎn)品，需關(guān)注凍融對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，復(fù)蘇后產(chǎn)品質(zhì)量應(yīng)能滿足臨床使用要求。對于不需冷凍的新鮮產(chǎn)品，貯存及運(yùn)輸?shù)臈l件和時(shí)間既要保證產(chǎn)品質(zhì)量，又需要滿足臨床使用的時(shí)效需求。

       四、風(fēng)險(xiǎn)評估與控制

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品具有多樣性、異質(zhì)性、復(fù)雜性等特點(diǎn)， 不同類型產(chǎn)品可能存在不同程度的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要基于產(chǎn)品的特點(diǎn)，從原材料、生產(chǎn)過程、產(chǎn)品質(zhì)控、穩(wěn)定性、臨床應(yīng)用過程等多方面因素，進(jìn)行綜合風(fēng)險(xiǎn)評估。可參考 ICH Q9 的風(fēng)險(xiǎn)管理理念，科學(xué)利用風(fēng)險(xiǎn)評估工具，對具體品種的各類風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行識別、分析和評估，并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果制定相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施。風(fēng)險(xiǎn)評估和控制貫穿于整個(gè)產(chǎn)品生命周期，需隨著研究的深入、產(chǎn)品認(rèn)知的積累，不斷對風(fēng)險(xiǎn)因素進(jìn)行跟蹤分析和更新，收集數(shù)據(jù)以進(jìn)一步確定其風(fēng)險(xiǎn)特征并制定相應(yīng)控制策略。

       根據(jù)目前產(chǎn)品研究情況，免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)方面的風(fēng)險(xiǎn)因素可能來源于以下幾大類：

       （1） 細(xì)胞的來源（如自體/同種異體、人源細(xì)胞系等）、獲取方式、類型和生物學(xué)特點(diǎn)（如增殖、分化、遷移能力、細(xì)胞自身功能、分泌活性物質(zhì)、啟動(dòng)/增強(qiáng)/抑制免疫應(yīng)答的能力等）。

       （2） 物料的安全性風(fēng)險(xiǎn)，如人源/動(dòng)物源性原材料的使用。

       （3） 細(xì)胞的生產(chǎn)過程，如設(shè)備開放/密閉性、生產(chǎn)過程 可能的混淆、內(nèi)外源性污染/交叉污染；對細(xì)胞的操作程度， 如體外培養(yǎng)/擴(kuò)增/活化/誘導(dǎo)/基因修飾/冷凍貯存/復(fù)蘇/運(yùn)輸?shù)龋徊僮鲗?xì)胞特性的影響程度，如基因修飾對細(xì)胞功能的影響 等。

       （4） 質(zhì)量研究和質(zhì)量控制，已有的研究和檢驗(yàn)手段或方法是否能充分表征產(chǎn)品的特性和控制產(chǎn)品的質(zhì)量，如生物學(xué)活性、純度研究（例如非目的細(xì)胞群、雜質(zhì)殘留、非細(xì)胞成分）等。檢測方法和檢測指標(biāo)是否適用，新建檢測方法驗(yàn)證是否充分，例如，新建檢測方法是否與藥典方法等效，新型快速檢測方法出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)等。

       （5） 生產(chǎn)用細(xì)胞和細(xì)胞終產(chǎn)品的貯存、運(yùn)輸條件和時(shí)間，貯存容器的密封性、相容性等。

       （6） 與非細(xì)胞材料（生物活性分子或結(jié)構(gòu)材料）形成 組合產(chǎn)品等。

       其他的風(fēng)險(xiǎn)因素類型可能包括：給藥方式（如系統(tǒng)性輸注、局部應(yīng)用或經(jīng)手術(shù)應(yīng)用）；受者的不同條件（如是否需要對受者進(jìn)行預(yù)處理，疾病的種類、分期、嚴(yán)重程度或進(jìn)展速度等）對產(chǎn)品的質(zhì)量、生產(chǎn)周期、貯存方式或運(yùn)輸時(shí)間的要求；既往類似產(chǎn)品的經(jīng)驗(yàn)或相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的可借鑒性等。

       五、生產(chǎn)用物料

       生產(chǎn)用物料系指免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中使用的所有原材料、輔料和耗材等，其來源應(yīng)當(dāng)清晰，質(zhì)量應(yīng)有保證，應(yīng)特別關(guān)注防止外源因子的引入或傳播。物料供應(yīng)商及合同生產(chǎn)商需經(jīng)過評估、審核，必要時(shí)，通過簽訂質(zhì)量協(xié)議等方式控制質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。

       （一）原材料

       原材料直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量，應(yīng)按照《中國藥典》“生物制品生產(chǎn)用原材料及輔料的質(zhì)量控制”的要求進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估和質(zhì)量控制，建立良好、規(guī)范的原材料質(zhì)量管理體系。基于免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品自身的特點(diǎn)及其生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)，建議盡量采用符合藥典標(biāo)準(zhǔn)或已經(jīng)批準(zhǔn)用于人體的原材料，否則應(yīng)盡量使用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)級別高、風(fēng)險(xiǎn)級別低的原材料，并確保其安全性和適用性。原材料包括起始原材料（如生產(chǎn)用細(xì)胞、生產(chǎn)輔助細(xì)胞、體外基因修飾系統(tǒng)）和其他原材料（如培養(yǎng)基、添加因子、其他生化試劑等）。

       1. 起始原材料

       1.1 生產(chǎn)用細(xì)胞

       根據(jù)目前生物技術(shù)的發(fā)展，生產(chǎn)用細(xì)胞來源包括人體供者來源（自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞）和人源細(xì)胞系來源。供者細(xì)胞的來源應(yīng)符合國家相關(guān)的法律法規(guī)和倫理的要求，并建立“知情與保密”管理體系。細(xì)胞系應(yīng)來源明確、傳代歷史清楚、安全性風(fēng)險(xiǎn)可控。

       1.1.1 供者來源的生產(chǎn)用細(xì)胞供者的篩選：

       為了保證產(chǎn)品質(zhì)量以及生產(chǎn)環(huán)境和生產(chǎn)人員的生物安全性，基于研究、產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)和供者細(xì)胞使用需求，需建立合理的供者篩選程序和標(biāo)準(zhǔn)，并盡量收集供者的相關(guān)特征，包括但不限于年齡、性別、既往已知的用藥情況和輻射暴露、疫區(qū)停留情況、既往病史、家族史、病原微生物篩查信息、HLA（human leukocyte antigen）分型信息、血型、血常規(guī)檢測等。供者篩選的標(biāo)準(zhǔn)因產(chǎn)品特點(diǎn)而異，但需要合理設(shè)定且能控制相應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。

       病原微生物篩查方面，同種異體供者應(yīng)至少符合國家對于獻(xiàn)血的相關(guān)規(guī)定，如篩查供者是否存在人類免疫缺陷病毒（ Human immunodeficiency virus， HIV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus， HCV）、梅毒螺旋體等感染。根據(jù)產(chǎn)品實(shí)際情況，還可增加相應(yīng)的檢測項(xiàng)目，對于一些特定產(chǎn)品，有明確風(fēng)險(xiǎn)且有明確病毒檢測要求的則需要進(jìn)行檢測，如 T 細(xì)胞治療產(chǎn)品的供者除上述病原微生物外，還建議進(jìn)行人巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）、人 EB 病毒、人類嗜 T 淋巴細(xì)胞病毒（Human T-cell Leukemia Virus ，HTLV）的篩查。自體供者也需要開展相應(yīng)的病原微生物篩查，以確保生產(chǎn)過程和 產(chǎn)品使用不會(huì)造成污染，或不會(huì)對患者自身增加額外的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)供者健康/疾病史或疫區(qū)生活停留等的具體情況還可適 時(shí)增加相應(yīng)的篩查項(xiàng)目，并建立驗(yàn)收的標(biāo)準(zhǔn)和程序。為了確 保檢測方法的靈敏度和檢測結(jié)果的可靠性，建議采用經(jīng)監(jiān)管 機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的試劑盒，并優(yōu)先采用血源篩查試劑盒檢測病原微 生物。同種異體供者還需考慮窗口期對病原微生物篩查的影 響。

       除病原微生物檢測外，根據(jù)臨床使用和生產(chǎn)需求，可增加對供者的篩查項(xiàng)目，例如對于同種異體來源的產(chǎn)品，建議適時(shí)評估包括多態(tài)性的分型，例如血型、供者和受者之間主要組織相容性抗原（Ⅰ類和/或Ⅱ類 HLA）的匹配，在某些情況下可能需關(guān)注次要組織相容性抗原，明確并建立分型程序和標(biāo)準(zhǔn)。

       細(xì)胞/組織的獲取、處理和檢驗(yàn)：

       為了保證供者細(xì)胞質(zhì)量滿足生產(chǎn)要求，需對負(fù)責(zé)細(xì)胞/組織采集的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行評估和審核，選擇具有相關(guān)資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)作為供者細(xì)胞/組織獲取的機(jī)構(gòu)，建立合作醫(yī)療機(jī)構(gòu)名單，制定相應(yīng)的細(xì)胞采集操作規(guī)范，并鼓勵(lì)簽訂相關(guān)質(zhì)量協(xié)議，同時(shí)定期對醫(yī)療機(jī)構(gòu)采集供者細(xì)胞/組織和臨床應(yīng)用細(xì)胞終產(chǎn)品的質(zhì)量情況進(jìn)行回顧分析和評估。

       細(xì)胞/組織的獲取操作過程需經(jīng)過充分研究。根據(jù)產(chǎn)品特 點(diǎn)并基于研究，確定細(xì)胞或組織來源、采集方法和其他相關(guān) 識別信息，包括但不限于采集場所/環(huán)境要求、使用的設(shè)備和 程序、采用的試劑耗材、采血量等。細(xì)胞/組織獲取包括單采 血采集、外周血采集、淋巴組織分離、臍帶血采集、腫瘤組 織分離等多種采集方式，建議綜合考慮細(xì)胞類型、供者健康 狀況和細(xì)胞需求量等，優(yōu)先選用易于標(biāo)準(zhǔn)化操作的采集方式， 如血液成分單采技術(shù)等。對獲得細(xì)胞/組織的方法需進(jìn)行研究 和論證，包括但不限于有關(guān)酶的類型、抗凝劑、血分儀器和 程序（循環(huán)血量、流速等）、手術(shù)方式等。采集中盡量減少 相關(guān)雜質(zhì)，如細(xì)胞碎片、非目的細(xì)胞含量等，并考慮降低對 供者組織、器官施加的破壞程度。避免不必要的或不適當(dāng)?shù)?加工和處理步驟，以避免損壞細(xì)胞的完整性和/或功能，進(jìn)而 降低發(fā)生不良反應(yīng)或者治療失敗的風(fēng)險(xiǎn)。采集細(xì)胞/組織的醫(yī) 務(wù)人員必須經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)，獲得相應(yīng)的資質(zhì)和授權(quán)方可上崗 操作，培訓(xùn)應(yīng)當(dāng)有記錄。實(shí)施采集操作的環(huán)境應(yīng)能保證采集 細(xì)胞/組織的微生物安全性。采集過程中應(yīng)對微生物污染、樣 品交叉污染或混淆風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行控制。

       采集的細(xì)胞/組織如果需要進(jìn)一步處理，如混合、分批、包裝、保存、運(yùn)輸?shù)?，需開展相應(yīng)的研究、驗(yàn)證工作，并根據(jù)研究情況確定適宜的保存條件、運(yùn)輸方式和時(shí)間，制定相應(yīng)操作規(guī)范。采集的細(xì)胞/組織在入廠時(shí)，需進(jìn)行外觀、包裝完整性等方面的檢查，以及運(yùn)輸溫度、時(shí)間和供者信息等方面的確認(rèn)。生產(chǎn)前，根據(jù)工藝要求、產(chǎn)品特點(diǎn)等，可進(jìn)行細(xì)胞類型、數(shù)量、表型、活率以及微生物等方面的檢測，如細(xì)胞類型可通過相關(guān)的基因型和/或表型標(biāo)志物進(jìn)行鑒定和確認(rèn)，標(biāo)志物陽性的細(xì)胞比例可以作為預(yù)期細(xì)胞群指標(biāo)評估的依據(jù)。鼓勵(lì)研究與成品質(zhì)量相關(guān)的細(xì)胞/組織質(zhì)量指標(biāo)，并納入采集細(xì)胞/ 組織質(zhì)量放行標(biāo)準(zhǔn)中。

       1.1.2 細(xì)胞系來源的生產(chǎn)用細(xì)胞

       人源細(xì)胞系來源的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品，其使用的細(xì)胞系應(yīng)滿足來源清楚，傳代歷史明確，檢定結(jié)果全面且合格等要求。原則上，應(yīng)對細(xì)胞系建立細(xì)胞庫并進(jìn)行分級管理，以用于生產(chǎn)。細(xì)胞庫的層級可根據(jù)細(xì)胞自身特性、生產(chǎn)情況和臨床應(yīng)用情況綜合考慮；并參照《中國藥典》、ICH Q5A、ICH Q5D 等相關(guān)要求建立細(xì)胞庫的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，檢驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合要求。細(xì)胞系可能經(jīng)過基因修飾后用于生產(chǎn)，如有可能，建議對基因修飾后的細(xì)胞系進(jìn)行建庫和檢驗(yàn)。

       1.1.3 生產(chǎn)用細(xì)胞的貯存

       建議建立或采用穩(wěn)定可控的細(xì)胞存儲體系或平臺，研究確定供者細(xì)胞或細(xì)胞系合適的保存條件和包裝材料，在不改變細(xì)胞特性的情況下，對細(xì)胞進(jìn)行妥善的保存，確保貯存過程中不增加微生物污染風(fēng)險(xiǎn)，并且細(xì)胞的活率、密度、純度和生物學(xué)功能等可滿足生產(chǎn)要求。

       1.2 生產(chǎn)輔助細(xì)胞

       根據(jù)用途或功能，生產(chǎn)輔助細(xì)胞可能為病毒包裝細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞（Feeder cells）等。生產(chǎn)輔助細(xì)胞，應(yīng)符合來源和培養(yǎng)傳代歷史清楚、安全性風(fēng)險(xiǎn)可控、進(jìn)行細(xì)胞庫分級管理（如適用）、檢驗(yàn)結(jié)果合格的基本原則。生產(chǎn)輔助細(xì)胞如需要擴(kuò)大培養(yǎng)，建議盡可能一次性完成最終生產(chǎn)輔助細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)，或確保每次擴(kuò)大培養(yǎng)工藝和質(zhì)量的一致性，并評估擴(kuò)大培養(yǎng)過程中是否引入了新的風(fēng)險(xiǎn)。如適用，建議建立不同生產(chǎn)步驟/階段的檢測程序，如檢測時(shí)間、檢驗(yàn)項(xiàng)目、檢測方法和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)等。需要關(guān)注其種屬特異性病毒檢測和可能引入的安全性風(fēng)險(xiǎn)。涉及滋養(yǎng)細(xì)胞失活處理的工藝，如輻照或添加藥物等，應(yīng)經(jīng)過研究與驗(yàn)證。

       1.3 基因修飾系統(tǒng)

       如涉及基因修飾，基因修飾系統(tǒng)部分請參考相關(guān)技術(shù)指南，不在本文贅述。

       2. 其他原材料

       細(xì)胞的采集、分選、培養(yǎng)以及對細(xì)胞進(jìn)行基因修飾過程中還需要使用多種材料，如培養(yǎng)基、酶、抗體、細(xì)胞因子、血清、抗生素、磁珠、其他化學(xué)品或固體支持物（例如凝膠基質(zhì)）等，這些材料的使用可能會(huì)影響免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量。其風(fēng)險(xiǎn)評估內(nèi)容包括原材料的來源、組分、功能、使用階段、質(zhì)量控制等，需要具備的相關(guān)文件包括來源證明、檢驗(yàn)報(bào)告書（COA）、說明書、無 TSE/BSE 聲明等，以證明其符合使用要求，適用于其預(yù)期用途?；陲L(fēng)險(xiǎn)情況，其生產(chǎn)過程可參照 GMP 的相關(guān)原則或要求。

       生產(chǎn)過程中如需使用抗原，需滿足來源清楚、風(fēng)險(xiǎn)和質(zhì)量可控的要求。重組表達(dá)或合成的抗原需明確選擇依據(jù)、抗原的序列、生產(chǎn)工藝相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素和質(zhì)量控制，明確抗原的雜質(zhì)控制（包括外源病毒因子等）情況。腫瘤細(xì)胞裂解物抗原需關(guān)注生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和質(zhì)量相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，如成瘤性或外源因子污染等。需充分評估免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品中抗原殘留可能引起的免疫相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)等。

       生產(chǎn)過程中盡量避免使用具有潛在致敏性的材料，如 β- 內(nèi)酰胺類抗生素（如青霉素）等。盡量避免使用動(dòng)物源原材 料，如動(dòng)物血清、動(dòng)物來源的蛋白質(zhì)，盡可能使用成分明確 的非動(dòng)物源性材料替代。如果必須使用動(dòng)物源原材料，需要 開展相應(yīng)的研究證明其使用的必要性和合理性，根據(jù)原材料 的物種來源、生產(chǎn)地區(qū)、生產(chǎn)工藝等特點(diǎn)建立完整的質(zhì)控體 系，評估 TSE/BSE 安全性風(fēng)險(xiǎn)，并對動(dòng)物源原材料殘留量進(jìn)行檢測及開展安全性風(fēng)險(xiǎn)評估。嚴(yán)禁使用疫區(qū)來源的動(dòng)物血 清/血漿，不得使用未經(jīng)過安全性驗(yàn)證的血清/血漿。如生產(chǎn)過 程使用自體血清或自體血漿，需要開展血清/血漿的生產(chǎn)工藝、質(zhì)量、穩(wěn)定性、包裝、貯存等研究。生產(chǎn)過程中盡量避免非藥用異體人血源性材料的使用，如確需使用，需要基于風(fēng)險(xiǎn)， 可以參考血液制品的相關(guān)要求，開展外源因子污染、有效性和批間一致性等方面的研究，并結(jié)合生產(chǎn)商放行檢測標(biāo)準(zhǔn)制定合理的內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

       （二）輔料

       輔料請見“生產(chǎn)工藝”章節(jié)中“制劑處方和工藝”部分。

       （三）耗材

       生產(chǎn)過程中使用的培養(yǎng)瓶、管路、濾器等一次性耗材、培養(yǎng)與包裝容器，及與中間樣品接觸的生產(chǎn)設(shè)備和材料等需經(jīng)過嚴(yán)格的篩選，開展適用性和生物安全性評估，并根據(jù)評估結(jié)果開展相應(yīng)的相容性研究。

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品可能與其他醫(yī)療器械、基質(zhì)、微囊等材料形成組合產(chǎn)品。細(xì)胞部分可以參考本指導(dǎo)原則。整體組合產(chǎn)品需考察和評估細(xì)胞與器械等材料的互相作用及風(fēng)險(xiǎn)。

       六、生產(chǎn)工藝

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)廠內(nèi)的生產(chǎn)工藝通常包括從供者細(xì)胞/組織接收或細(xì)胞系起始培養(yǎng)到最終細(xì)胞收獲、制劑、貯存和運(yùn)送出廠的全過程。整體生產(chǎn)工藝需進(jìn)行充分的研究和驗(yàn)證，以確定穩(wěn)定可行的商業(yè)化生產(chǎn)工藝，包括但不限于細(xì)胞接收、采集細(xì)胞的凍存（如適用）、體外操作、制劑、產(chǎn)品冷凍等。確定的生產(chǎn)工藝包括合理的工藝操作步驟和參數(shù)、生產(chǎn)過程控制和可接受標(biāo)準(zhǔn)等。生產(chǎn)的全過程需進(jìn)行監(jiān)控，包括工藝參數(shù)和過程控制指標(biāo)的監(jiān)測等。組合產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的研究和驗(yàn)證還需包括單獨(dú)成分組合形成最終組合產(chǎn)品的所有工藝步驟，以保證生產(chǎn)工藝的可行性和穩(wěn)定性。

       （一）工藝研究

       隨著研究的深入，生產(chǎn)工藝需不斷優(yōu)化。工藝研究中建 議盡量采用與生產(chǎn)實(shí)際來源、質(zhì)量一致的細(xì)胞/組織開展研究。如果細(xì)胞量有限（如自體細(xì)胞產(chǎn)品），可考慮采用具有相似 特征、具有代表性且有足夠數(shù)量的細(xì)胞進(jìn)行研究。

       1. 生產(chǎn)產(chǎn)能和批次定義

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)產(chǎn)能的大小直接影響到可接受治療的患者人數(shù)、治療的次數(shù)及產(chǎn)品的質(zhì)量，由細(xì)胞特性、生產(chǎn)工藝、廠房、人員、設(shè)施設(shè)備、臨床用途等多種因素決定。生產(chǎn)產(chǎn)能的制定需要經(jīng)過研究驗(yàn)證。在從實(shí)驗(yàn)室制備向工業(yè)生產(chǎn)轉(zhuǎn)化的階段，需關(guān)注生產(chǎn)產(chǎn)能擴(kuò)大的方式，開展研究保證產(chǎn)品質(zhì)量。如果在生產(chǎn)產(chǎn)能擴(kuò)大研究中，始終保持生產(chǎn)工藝不變和每批產(chǎn)品批生產(chǎn)量不變，而是通過增加生產(chǎn)批次的方式擴(kuò)大生產(chǎn)產(chǎn)能時(shí)，需重點(diǎn)關(guān)注原輔料、人員、公共設(shè)施、設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境和質(zhì)量監(jiān)控及檢驗(yàn)等方面的驗(yàn)證，以確保產(chǎn)能擴(kuò)大不會(huì)對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生影響。如果在生產(chǎn)產(chǎn)能擴(kuò)大研究中，引入了新的生產(chǎn)工藝，如采用了多層細(xì)胞工廠或者細(xì)胞反應(yīng)器等設(shè)備，需重點(diǎn)關(guān)注變更工藝對質(zhì)量的可能影響，開展相應(yīng)的可比性研究或評估。

       定義批次的目的是保證免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量均一性和可追溯性。同一批次的產(chǎn)品，應(yīng)來源一致、質(zhì)量均一， 按規(guī)定要求抽樣檢驗(yàn)后，能對整批產(chǎn)品做出質(zhì)量評定。由于免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品工藝多樣、復(fù)雜，可結(jié)合產(chǎn)品工藝特點(diǎn)制定適用的批次定義。根據(jù)現(xiàn)有產(chǎn)品工藝情況，免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品批次可考慮定義為：在同一生產(chǎn)周期中，采用相同生產(chǎn)工藝、在同一生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的一定數(shù)量的質(zhì)量均一的產(chǎn)品為一批。單一批次所生產(chǎn)出來的所有細(xì)胞的總量為此次生產(chǎn)的批量。

       2. 生產(chǎn)工藝開發(fā)

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品工藝開發(fā)需根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量概況， 結(jié)合理化特性和生物學(xué)特征，合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，不斷優(yōu)化，逐步建立穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝和關(guān)鍵工藝參數(shù)。對于目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量概況研究，需從多個(gè)方面對產(chǎn)品的特征如表面標(biāo)志物、細(xì)胞活率、純度、生物學(xué)活性、目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率等進(jìn)行分析， 并從中初步獲得可能影響產(chǎn)品安全性和有效性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。根據(jù)工藝參數(shù)對關(guān)鍵質(zhì)量屬性的影響來確定關(guān)鍵工藝參數(shù)，并建立相匹配的參數(shù)范圍，隨著工藝研究的深入和經(jīng)驗(yàn)的積累而不斷優(yōu)化?？赡艿年P(guān)鍵工藝參數(shù)包括但不限于：起始細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)基組成，細(xì)胞擴(kuò)增、誘導(dǎo)、基因修飾操作相關(guān)工藝參數(shù)等。

       在細(xì)胞體外培養(yǎng)工藝開發(fā)中，需考慮細(xì)胞體外生長的條 件和任何操作可能對細(xì)胞的影響，以保持細(xì)胞的完整性和功 能特性。對操作的步驟（換液、傳代、激活、基因修飾、誘 導(dǎo)等）、添加的成分（培養(yǎng)基、重組蛋白及相關(guān)生長因子、血清替代物、磁珠、病毒載體、核酸物質(zhì)、促轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染試劑 等）、培養(yǎng)容器、培養(yǎng)條件（如溫度、溶氧、pH 等）、雜質(zhì)去除、培養(yǎng)時(shí)間或最大傳代次數(shù)、培養(yǎng)規(guī)模和參數(shù)設(shè)置等都 應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相應(yīng)的研究和驗(yàn)證。為了監(jiān)測細(xì)胞質(zhì)量情況，建議 建立檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，持續(xù)監(jiān)測生產(chǎn)過程中細(xì)胞的特性情況， 如細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后細(xì)胞的基因型和/或表型以及功能的變化 等以確定或優(yōu)化生產(chǎn)工藝。

       如果細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)不是液態(tài)培養(yǎng)基，而是非液態(tài)基質(zhì)/器械/支架內(nèi)（上）等培養(yǎng)介質(zhì)，需考慮其對細(xì)胞生長、功能和完整性的影響，例如可降解生物材料可能引起的細(xì)胞環(huán)境變化（如 pH 值、離子濃度、氣-液界面等改變），同時(shí)還應(yīng)考慮細(xì)胞可能對培養(yǎng)介質(zhì)產(chǎn)生的影響（如降解速率、介質(zhì)形態(tài)、介質(zhì)組成成分等）。

       若存在細(xì)胞體外誘導(dǎo)的操作，需對誘導(dǎo)的方法和條件進(jìn)行研究，結(jié)合細(xì)胞生長特性的變化、細(xì)胞的表型和/或基因型的變化、細(xì)胞功能的變化、誘導(dǎo)物質(zhì)的殘留、目的細(xì)胞群和非目的細(xì)胞群的比例變化進(jìn)行研究和驗(yàn)證，并不斷優(yōu)化。

       若存在細(xì)胞體外基因修飾的操作，需對操作的方法（如電轉(zhuǎn)、病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)等）和條件，例如促轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染試劑的選擇、轉(zhuǎn)導(dǎo)設(shè)備（如電轉(zhuǎn)儀）、病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）等條件進(jìn)行研究，并可結(jié)合目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染效率、目的基因在染色體中的整合情況、目的基因表達(dá)穩(wěn)定性、細(xì)胞基因型和

       /或表型、功能的變化、致癌性等風(fēng)險(xiǎn)基因的殘留和去除、病毒復(fù)制能力回復(fù)突變、插入突變或插入位點(diǎn)等進(jìn)行工藝的研究、優(yōu)化和驗(yàn)證。

       3. 制劑處方和工藝

       制劑研究的總體目標(biāo)是確保劑型和處方合理，工藝穩(wěn)定， 有效控制生產(chǎn)過程，適合工業(yè)化生產(chǎn)。研究中根據(jù)產(chǎn)品自身 的特性和臨床應(yīng)用情況確定產(chǎn)品的劑型、制劑處方和處方工 藝。制劑研究一般包括：

       （1） 劑型的選擇

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品一般為注射劑。如果使用其他劑型， 應(yīng)當(dāng)結(jié)合臨床使用情況合理選擇。

       （2） 處方研究

       根據(jù)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的特性、穩(wěn)定性研究結(jié)果等，結(jié)合劑型特點(diǎn)、用法和給藥途徑，合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)行處方篩選和優(yōu)化，最終確定處方。處方研究主要關(guān)注規(guī)格、輔料成分和用量、用法，以及產(chǎn)品在貯存、運(yùn)輸、使用等過程中的穩(wěn)定性表現(xiàn)等。制劑處方應(yīng)與貯存條件相適應(yīng)，免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品常涉及冷藏和/或冷凍。研究中，應(yīng)驗(yàn)證細(xì)胞冷藏和/或冷凍條件和時(shí)間等對細(xì)胞特性和活力狀態(tài)的影響，以確定制劑處方。非冷凍免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的貯存時(shí)間通常較短，其制劑處方應(yīng)能滿足在貯存、運(yùn)輸和使用期間產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的要求。

       輔料的使用、用量和質(zhì)量情況應(yīng)加以研究和驗(yàn)證，證明其使用的必要性、安全性和合理性。宜優(yōu)選藥用或經(jīng)批準(zhǔn)可用于人體的輔料，否則需要開展全面的研究與評估。對于新型的輔料，除以上研究外，建議開展適當(dāng)?shù)姆桥R床安全性研究，具體可以參考已經(jīng)發(fā)布的相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則。冷凍的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品常用冷凍保護(hù)劑，其主要分為穿透性冷凍保護(hù)劑（如二甲基亞砜（DMSO）、甘油、乙二醇等）和非穿透性冷凍保護(hù)劑（如聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白、蔗糖、海藻糖等）。在選擇細(xì)胞冷凍保護(hù)劑時(shí)，可能考慮的因素：細(xì)胞冷凍保護(hù)劑本身的**及免疫原性（如 DMSO、白蛋白等），對細(xì)胞特性、功能及穩(wěn)定性的影響，去除方法或殘留量的可接受標(biāo)準(zhǔn)，冷凍的設(shè)備和程序方法，細(xì)胞冷凍保護(hù)劑的質(zhì)量、來源、成分、用量、用法等。研究中應(yīng)當(dāng)驗(yàn)證細(xì)胞冷凍保護(hù)劑（如 DMSO 等）的成分、用量及其合理性。結(jié)合選用的冷凍保護(hù)劑，如果產(chǎn)品在給受者使用前需要經(jīng)過物理狀態(tài)改變、過濾、清洗、容器轉(zhuǎn)換、調(diào)整劑量、與其他材料聯(lián)用等操作， 應(yīng)進(jìn)行充分的研究和驗(yàn)證。

       （3） 制劑工藝研究

       根據(jù)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的特性、穩(wěn)定性研究結(jié)果等情況， 結(jié)合生產(chǎn)條件和設(shè)備，進(jìn)行工藝研究和驗(yàn)證，確定制劑生產(chǎn) 工藝并建立適當(dāng)?shù)倪^程控制標(biāo)準(zhǔn)。制劑工藝研究可以單獨(dú)進(jìn) 行，也可以結(jié)合處方研究同時(shí)進(jìn)行。制劑工藝研究需要考慮 混淆和污染的風(fēng)險(xiǎn)防控，制劑工藝過程中接觸材料（容器） 對細(xì)胞的吸附或作用，灌裝產(chǎn)生的剪切力對細(xì)胞的影響等， 同時(shí)確保細(xì)胞數(shù)量和密度等滿足要求。

       （二）過程控制

       良好的過程控制是保證產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵。合理設(shè)立生產(chǎn)過程控制的取樣時(shí)間點(diǎn)、檢測項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)或相關(guān)工藝參數(shù)的輸出標(biāo)準(zhǔn)，以確保產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和不同批次間產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。對于封閉式細(xì)胞培養(yǎng)體系，可依據(jù)封閉系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、取樣流程等特點(diǎn)酌情安排過程控制的取樣操作，防止污染。

       根據(jù)產(chǎn)品和生產(chǎn)工藝特點(diǎn)建立合理的過程控制策略，建議關(guān)注以下幾個(gè)方面：（1）監(jiān)控樣品混淆和交叉污染，包括生產(chǎn)過程中的供者材料、中間樣品和產(chǎn)品，尤其注意不同供者或細(xì)胞系來源的細(xì)胞操作應(yīng)進(jìn)行時(shí)間/空間有效隔離；每次生產(chǎn)結(jié)束后需進(jìn)行清場，采用經(jīng)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行清潔及消毒處理。每次生產(chǎn)操作前，對清場情況進(jìn)行確認(rèn)。（2）監(jiān)控微生物及其代謝產(chǎn)物/衍生物（如內(nèi)毒素）污染，如適用，建議在關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)對適合的中間樣品開展無菌、支原體等安全性相關(guān)檢測或采取相關(guān)的措施加以控制。（3）監(jiān)控生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵工藝參數(shù)或關(guān)鍵質(zhì)量屬性，如細(xì)胞活率、增殖能力、細(xì)胞表型、雜質(zhì)含量、生物學(xué)活性等。過程中的質(zhì)量監(jiān)控與放行檢測可相互結(jié)合與補(bǔ)充。（4）確保生產(chǎn)全過程樣品和生產(chǎn)物料（包括從細(xì)胞/組織采集過程、生產(chǎn)、運(yùn)輸?shù)脚R床應(yīng)用整個(gè)過程）的可追溯性。

       （三）工藝驗(yàn)證

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品工藝驗(yàn)證可遵循生物制品工藝驗(yàn)證的一般原則，對已經(jīng)確定生產(chǎn)工藝的各個(gè)操作單元、中間樣品存儲條件和時(shí)間、培養(yǎng)基/緩沖液制備和存儲條件、運(yùn)輸過程等進(jìn)行工藝驗(yàn)證。工藝驗(yàn)證應(yīng)當(dāng)能證明生產(chǎn)工藝按照規(guī)定的工藝參數(shù)能夠持續(xù)生產(chǎn)出符合預(yù)定用途和注冊要求的產(chǎn)品。

       在符合倫理和知情同意的情況下，工藝驗(yàn)證中建議采用與臨床應(yīng)用情境類似的細(xì)胞（如患者來源細(xì)胞）開展相應(yīng)的研究；在工藝研究充分的情況下，自體細(xì)胞治療產(chǎn)品或其他細(xì)胞來源受限的產(chǎn)品，也可以考慮采用經(jīng)研究和評估認(rèn)為具有代表性的健康供者細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)工藝驗(yàn)證，并同時(shí)考慮在上市后開展同步驗(yàn)證。

       驗(yàn)證工作中需關(guān)注同時(shí)同階段生產(chǎn)最大產(chǎn)能的研究與驗(yàn)證，實(shí)際生產(chǎn)的最大產(chǎn)能不得超過經(jīng)驗(yàn)證的最大產(chǎn)能，產(chǎn)能的增加需要經(jīng)過適當(dāng)?shù)尿?yàn)證。研究中需考慮原輔料、人員、設(shè)施設(shè)備、環(huán)境、質(zhì)量檢測能力、整體運(yùn)行能力等方面對最大產(chǎn)能的支持能力，考慮對最差條件的驗(yàn)證。完成商業(yè)化生產(chǎn)工藝驗(yàn)證后，還需進(jìn)行持續(xù)工藝研究與驗(yàn)證，保證工藝處于受控狀態(tài)。

       七、質(zhì)量研究與質(zhì)量控制

       （一）質(zhì)量研究

       質(zhì)量研究是工藝優(yōu)化與改進(jìn)、制定整體控制策略及保證產(chǎn)品質(zhì)量的基礎(chǔ)，貫穿于產(chǎn)品的全生命周期，全面的質(zhì)量研究有利于關(guān)鍵質(zhì)量屬性的確定，需隨著對產(chǎn)品認(rèn)識的深入和技術(shù)的發(fā)展不斷補(bǔ)充和完善。質(zhì)量研究需采用相應(yīng)研究階段（如非臨床研究批次、臨床試驗(yàn)批次、商業(yè)化生產(chǎn)批次）或適當(dāng)步驟（如供者細(xì)胞或細(xì)胞系細(xì)胞、生產(chǎn)過程中間樣品或成品）的代表性樣品。

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量研究一般包括安全性研究、純度和雜質(zhì)研究、功能性研究、其他項(xiàng)目的研究等，也可根據(jù)產(chǎn)品的自身特點(diǎn)增加其他相關(guān)的研究。

       1. 安全性研究

       主要包括微生物安全性研究和產(chǎn)品本身相關(guān)的安全性研究。前者是指對微生物污染和微生物代謝產(chǎn)物/衍生物污染的研究，如真菌、細(xì)菌、支原體、病毒、內(nèi)毒素等；后者是指除微生物學(xué)安全性外，對產(chǎn)品本身可能導(dǎo)致安全性問題的相關(guān)研究，如細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、非目的細(xì)胞殘留等。根據(jù)細(xì)胞種類、特性和來源、生產(chǎn)工藝和相關(guān)物料特點(diǎn)進(jìn)行上述兩方面的安全性研究。建議至少包括以下幾個(gè)方面（如適用）：

       外源因子：生產(chǎn)用細(xì)胞、生產(chǎn)輔助細(xì)胞、其他人源/動(dòng)物源性原材料，以及生產(chǎn)過程中都可能引入外源因子。在進(jìn)行常規(guī)外源因子檢測的基礎(chǔ)上，根據(jù)可能引入的外源因子，可結(jié)合體內(nèi)和體外方法開展特定外源因子的檢測。例如，生產(chǎn)中若使用牛血清，需進(jìn)行牛源特定病毒的檢測；若使用豬胰酶，需進(jìn)行豬源特定病毒的檢測；若使用滋養(yǎng)細(xì)胞，需進(jìn)行細(xì)胞種屬特異性病毒的檢測。對于同種異體治療產(chǎn)品，在開展人源病毒檢測時(shí)，應(yīng)關(guān)注供者處于感染窗口期的可能，適時(shí)開展二次取樣和檢測。

       復(fù)制型病毒（Replication competent virus，RCV）：RCV 通過病毒載體回復(fù)突變產(chǎn)生，是與產(chǎn)品安全性相關(guān)的重要檢測項(xiàng)目，需要通過適用的檢測方法進(jìn)行研究。

       細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化：某些情況下，產(chǎn)品中的細(xì)胞有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化（包括但不限于成瘤性、促/致瘤性等）的可能性。在此種情況下，可根據(jù)免疫細(xì)胞的來源、產(chǎn)品中目的細(xì)胞的特點(diǎn)或殘留雜質(zhì)情況等因素，結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的可能性進(jìn)行研究和評估。

       基因插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)：由于其關(guān)系到產(chǎn)品的安全性和有效性，需采用適用的檢測方法進(jìn)行研究，探索其與安全性和療效的相關(guān)性。

       異常免疫反應(yīng)：建議對異體來源的細(xì)胞產(chǎn)品選擇適用的方法進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)檢測。

       非目的細(xì)胞和雜質(zhì)研究：具體見下文。

       2. 純度和雜質(zhì)研究

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量和生物學(xué)活性往往和產(chǎn)品中目的細(xì)胞的純度相關(guān)。實(shí)際情況可能比較復(fù)雜：一方面，不同類型產(chǎn)品對目的細(xì)胞純度要求各不相同；另一方面，同一類型產(chǎn)品中不同的細(xì)胞群或亞群對產(chǎn)品生物學(xué)活性的影響也各不相同，需要研究不同細(xì)胞群或亞群的細(xì)胞比例。細(xì)胞純度研究可能包括但不限于：

       活細(xì)胞比例：需要采用適用的方法對活細(xì)胞比例進(jìn)行研究。當(dāng)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品為單一細(xì)胞種類并具有均一性時(shí)， 可以通過直接檢測產(chǎn)品中活細(xì)胞的比例來研究產(chǎn)品的純度。

       細(xì)胞群或亞群比例：當(dāng)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品為多種不同類型或不同基因型/表型細(xì)胞所組成的混合物時(shí)，建議研究樣品中細(xì)胞的組成成分，如細(xì)胞群或亞群的組成和比例。如，根據(jù)成熟階段（幼稚、衰老、耗竭等），對免疫細(xì)胞群或亞群進(jìn)行研究。

       目的細(xì)胞的比例：可通過檢測目的細(xì)胞比例來研究產(chǎn)品的純度。比如在 CAR-T 產(chǎn)品中，在進(jìn)行了 CAR 轉(zhuǎn)入的操作后，純度分析的目的細(xì)胞群應(yīng)選擇能同時(shí)正確表達(dá) CAR 和T 細(xì)胞表面標(biāo)志物的目的細(xì)胞，不能包括未表達(dá) CAR 的 T 細(xì)胞和雖表達(dá) CAR 但 T 細(xì)胞表面標(biāo)志物不正確的細(xì)胞。

       非目的細(xì)胞的比例：非目的細(xì)胞對產(chǎn)品質(zhì)量可能具有不利的影響，因此，細(xì)胞純度研究還應(yīng)包括非目的細(xì)胞的定性和/或定量研究。例如腫瘤細(xì)胞、iPS 細(xì)胞等非目的細(xì)胞的殘留具有較高安全性風(fēng)險(xiǎn)，因此需要進(jìn)行其比例的研究并進(jìn)行嚴(yán)格的控制。經(jīng)研究，當(dāng)非目的細(xì)胞對產(chǎn)品安全性和有效性不產(chǎn)生影響時(shí)，需研究其組成和比例，必要時(shí)，控制批間一致性。

       雜質(zhì)：

       工藝相關(guān)雜質(zhì)：是指工藝中引入的雜質(zhì)，如殘留的蛋白酶、誘導(dǎo)試劑、促轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染試劑、血清、病毒載體、以及殘留的磁珠、纖維和塑料微體、滋養(yǎng)細(xì)胞等，需采用適用的方法進(jìn)行研究。

       產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)：如非目的細(xì)胞、細(xì)胞非預(yù)期表達(dá)的產(chǎn)物、死細(xì)胞殘留、細(xì)胞碎片和其他可能的降解產(chǎn)物等，需采用適用的方法進(jìn)行研究。

       對于產(chǎn)品中可能存在的高風(fēng)險(xiǎn)雜質(zhì)成分，應(yīng)當(dāng)建立和明確去除方法及殘留定量檢測方法，如果雜質(zhì)成分不能有效去除，則應(yīng)當(dāng)在動(dòng)物模型或其他系統(tǒng)中進(jìn)行安全性和**評估， 并根據(jù)人體暴露最大劑量或體內(nèi)安全性研究結(jié)果設(shè)定殘留 限度。

       3. 功能性研究

       功能性研究是通過體內(nèi)/外功能分析實(shí)驗(yàn)來評價(jià)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品是否具備預(yù)期的生物學(xué)功能的研究。根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)品的性質(zhì)、特點(diǎn)和預(yù)期用途（適應(yīng)癥），尤其是實(shí)現(xiàn)臨床治療效果的具體機(jī)制和指標(biāo)，建立和驗(yàn)證合適的體內(nèi)/外功能性分析方法，開展功能性研究。其功能性研究可能包括但不限于以下方面：

       分化/發(fā)育潛能：可涵蓋產(chǎn)品中細(xì)胞可能的分化/發(fā)育方向。其中，與臨床應(yīng)用安全性和有效性相關(guān)的分化/發(fā)育功能建議作為代表性評價(jià)內(nèi)容納入質(zhì)量控制。

       表達(dá)產(chǎn)物的定性與定量研究：當(dāng)免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品功能涉及內(nèi)源或外源基因產(chǎn)物的表達(dá)時(shí)，應(yīng)開展對表達(dá)產(chǎn)物的研究，例如表達(dá)產(chǎn)物的種類、特性、表達(dá)水平、修飾程度（如糖基化、磷酸化等）、聚合性（如同源或異源聚合物等）等。對外源性刺激的應(yīng)答：可研究相關(guān)因素作用于細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)反應(yīng)，如細(xì)胞形態(tài)的改變、細(xì)胞增殖能力的改變、細(xì)胞因子的分泌、表型的變化、信號通路的改變、代謝的改變等。

       生物學(xué)活性：根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)和作用機(jī)制，開展與產(chǎn)品體內(nèi)預(yù)期功能相應(yīng)的生物學(xué)活性研究，如靶細(xì)胞的效應(yīng)（如溶解反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或增殖）、分泌特定因子等。如果生產(chǎn)過程中通過添加成分刺激（如誘導(dǎo)、抗原負(fù)荷等），或者進(jìn)行基因修飾（如基因編輯、外源基因表達(dá)等）后獲得功能性細(xì)胞，需對刺激或操作前、后的細(xì)胞開展適用的生物學(xué)活性研究，對比分析刺激或操作前、后細(xì)胞的功能情況。當(dāng)直接的研究試驗(yàn)受到所需細(xì)胞數(shù)量或其他條件限制時(shí)，可研發(fā)和實(shí)施合理的替代性檢測方法。

       4. 其他項(xiàng)目的研究

       理化特性方面，可根據(jù)產(chǎn)品特性和劑型，對外觀、pH、滲透壓、明顯可見異物等進(jìn)行研究。

       細(xì)胞活率和增殖能力方面，可采用適用的檢測方法，如活細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞倍增時(shí)間分析、細(xì)胞周期分析、克隆形成率分析等進(jìn)行研究。

       某些免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的生產(chǎn)和/或使用可能需要將多種不同類型的細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行混合，可對產(chǎn)品的混合特性進(jìn)行質(zhì)量研究，并確定混合產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。在混合前，應(yīng)對各獨(dú)立的免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品分別開展相關(guān)質(zhì)量研究，分別確定各自的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

       （二）質(zhì)量控制

       1. 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

       質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需基于全面的風(fēng)險(xiǎn)分析、積累的生產(chǎn)和臨床研究經(jīng)驗(yàn)以及統(tǒng)計(jì)分析（如適用）、可靠的科學(xué)知識，并結(jié)合質(zhì)量研究、穩(wěn)定性研究等結(jié)果而制定。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括檢驗(yàn)項(xiàng)目、檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)限度?？梢罁?jù)檢測需求合理設(shè)置樣品檢測階段，如中間樣品、放行檢測、留樣樣本等，以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。檢驗(yàn)項(xiàng)目一般包括鑒別、生物學(xué)活性、純度、雜質(zhì)、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)（如適用）、細(xì)胞數(shù)量（活細(xì)胞數(shù)、功能細(xì)胞數(shù)/比例等）和一般檢測（如 pH、滲透壓、無菌、支原體、細(xì)菌內(nèi)毒素、外觀、明顯可見異物等）等。

       （1） 檢驗(yàn)項(xiàng)目和檢測方法

       細(xì)胞鑒別：建議采用適用的、特異性強(qiáng)的檢測方法，必要時(shí)，采用多種方法進(jìn)行鑒別。采用的方法可能為細(xì)胞形態(tài)、HLA 分析、遺傳多態(tài)性分析、核型分析、STR 分析、代謝酶亞型譜分析、細(xì)胞表面標(biāo)志物及特定基因表達(dá)產(chǎn)物分析等。

       純度：結(jié)合質(zhì)量研究，根據(jù)產(chǎn)品特征選用純度檢測的指標(biāo)，如細(xì)胞表面標(biāo)志物、特定生物學(xué)活性等。

       無菌和支原體：依據(jù)《中國藥典》無菌檢查法和支原體檢查法，對細(xì)菌、真菌及支原體進(jìn)行檢測。當(dāng)檢驗(yàn)樣品量有限，或需要快速放行等特殊情況下，如藥典方法無法滿足， 可考慮開發(fā)新型的無菌和支原體的檢測方法進(jìn)行放行檢測， 但是新型檢測方法應(yīng)經(jīng)過充分驗(yàn)證。在積累數(shù)據(jù)階段，可以并行采用經(jīng)充分驗(yàn)證的新型方法和藥典方法。

       細(xì)菌內(nèi)毒素：依據(jù)《中國藥典》中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法對細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測，或采用其他經(jīng)過驗(yàn)證的適用方法。

       細(xì)胞內(nèi)源和外源病毒因子：根據(jù)質(zhì)量研究的結(jié)果確定免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品及其生產(chǎn)過程中可能引入的內(nèi)、外源病毒因子，在此基礎(chǔ)上選擇合適的方法如細(xì)胞培養(yǎng)法、核酸或蛋白檢測法、熒光抗體檢測法等進(jìn)行內(nèi)、外源病毒因子檢測。

       復(fù)制型病毒（RCV）：對于使用病毒載體進(jìn)行基因修飾的免疫細(xì)胞產(chǎn)品，RCV 作為重要的安全性風(fēng)險(xiǎn)關(guān)注點(diǎn)，除了病毒載體階段的檢測控制外，細(xì)胞終產(chǎn)品還需建立完善的檢測和風(fēng)險(xiǎn)控制策略。當(dāng)細(xì)胞放行檢測采用快速 RCV 檢測方法時(shí)，建議進(jìn)行留樣。在臨床試驗(yàn)階段或上市早期階段用指示細(xì)胞培養(yǎng)法采用留樣進(jìn)行并行檢測分析，積累數(shù)據(jù)；在上市后成熟階段，留樣可以作為必要時(shí)的研究分析。

       生物學(xué)活性：建議選擇可表征產(chǎn)品生物學(xué)活性且適宜用于放行檢測的方法。某些情況下，如產(chǎn)品具有多種作用機(jī)制， 或單一檢測方法不能充分反映其作用機(jī)制的情況下，可考慮采用一種以上的方法進(jìn)行生物學(xué)活性檢測。

       雜質(zhì)控制：根據(jù)生產(chǎn)工藝和質(zhì)量研究的結(jié)果，明確產(chǎn)品生產(chǎn)過程中殘留的、可能影響產(chǎn)品質(zhì)量的工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，選擇適用的方法進(jìn)行檢測和控制。對于一般工藝相關(guān)雜質(zhì)，如經(jīng)充分驗(yàn)證證明工藝可對其有效、穩(wěn)定地清除，可結(jié)合工藝進(jìn)行控制。

       成瘤性/致瘤性：如適用，可根據(jù)質(zhì)量研究結(jié)果，考慮是否納入成瘤性/致瘤性控制項(xiàng)目。

       除以上例舉的檢測項(xiàng)目和方法外，可以結(jié)合實(shí)際研究情況進(jìn)行合理的調(diào)整。

       （2） 標(biāo)準(zhǔn)限度

       質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度制定可依據(jù)產(chǎn)品研發(fā)相關(guān)數(shù)據(jù)、非臨床研究批次檢測數(shù)據(jù)、臨床試驗(yàn)批次檢測數(shù)據(jù)、工藝驗(yàn)證數(shù)據(jù)以及穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)等，同時(shí)可兼顧產(chǎn)品的特點(diǎn)和目前的科學(xué)認(rèn)知與共識。建議重點(diǎn)依據(jù)臨床試驗(yàn)批次的檢測數(shù)據(jù)制定標(biāo)準(zhǔn)限度。

       2. 檢測方法的驗(yàn)證

       檢測方法應(yīng)經(jīng)過研究與驗(yàn)證，特別是自建的產(chǎn)品特異性的方法。藥典中收錄的方法應(yīng)進(jìn)行適用性確認(rèn)。藥典方法經(jīng)過修訂或替代時(shí)，需驗(yàn)證其合理性。

       方法學(xué)驗(yàn)證研究需關(guān)注陽性對照、陰性對照、抑制性對照（如適用）、供試品取樣代表性和取樣量、檢測指標(biāo)、判定標(biāo)準(zhǔn)等方面的合理性。

       對于有效期短或樣本量小的產(chǎn)品，可考慮采用快速、微量的新型檢測方法。新型檢測方法應(yīng)進(jìn)行充分的驗(yàn)證，并與藥典檢測方法進(jìn)行比較和評估（如適用）。

       研發(fā)過程中如出現(xiàn)檢測方法的變更，應(yīng)對變更方法進(jìn)行評估和研究，證明擬變更方法優(yōu)于或等效于變更前方法。

       3. 標(biāo)準(zhǔn)品/對照品

       在條件許可的情況下，可依據(jù)需要建立標(biāo)準(zhǔn)品/對照品， 以滿足檢測的需求，并有助于確定設(shè)備和試劑在規(guī)定的范圍內(nèi)工作，提高檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

       建立的標(biāo)準(zhǔn)品/對照品需有明確的預(yù)期用途，采用經(jīng)驗(yàn)證的檢測方法進(jìn)行檢驗(yàn)和標(biāo)定，開發(fā)各個(gè)階段使用的標(biāo)準(zhǔn)品/對照品應(yīng)可以溯源，并且還需開展相應(yīng)的穩(wěn)定性研究。

       4. 其他情況

       產(chǎn)品放行檢測是確保產(chǎn)品質(zhì)量滿足臨床應(yīng)用的重要保障，但是部分免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品因時(shí)效較短，可能無法在臨床使用前完成全部放行檢測。在這種情況下，如果風(fēng)險(xiǎn)被充分研究評估，并經(jīng)過驗(yàn)證證明可控的情況下，可以考慮在完整放行檢測結(jié)果獲得前先行使用（使用放行）；當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)未被充分研究評估或評估認(rèn)為可能造成嚴(yán)重的無法挽回的后果時(shí)，則不建議考慮使用放行。

       為加強(qiáng)質(zhì)量控制，降低風(fēng)險(xiǎn)，建議考慮以下一些措施：

       （1） 在放行檢測時(shí)間受限時(shí)，可考慮加強(qiáng)原材料的質(zhì)量控制和過程控制，將其與放行檢測相結(jié)合，控制風(fēng)險(xiǎn)。

       （2） 檢測方法方面，可采用快速替代檢測方法進(jìn)行檢測，以最 大 程 度控制風(fēng)險(xiǎn)。在充分完成替代檢測方法驗(yàn)證前，需開展藥典方法和替代檢測方法的平行檢測，積累數(shù)據(jù)并在研 究中不斷優(yōu)化。

       （3） 在使用放行的同時(shí)，應(yīng)繼續(xù)完成完整的放行檢測。需充分考慮相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，提前制定措施，當(dāng)后置的放行檢測結(jié)果出現(xiàn)異?；虿缓细駮r(shí)，需啟動(dòng)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)適用的緊急預(yù)案。

       5. 使用前的質(zhì)量核準(zhǔn)

       產(chǎn)品在給藥前需進(jìn)行質(zhì)量核準(zhǔn)，特別是存在使用前細(xì)胞復(fù)蘇、稀釋等操作的情況。核準(zhǔn)的內(nèi)容可包括但不限于：標(biāo)簽核對；貯存和運(yùn)輸條件復(fù)核；操作步驟復(fù)核；外觀、明顯可見異物的觀察；細(xì)胞形態(tài)觀察（如適用）；活細(xì)胞數(shù)及比例測定（如適用）；快速無菌檢測（如適用）等。

       八、穩(wěn)定性研究

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究是通過設(shè)計(jì)試驗(yàn)，獲得其質(zhì)量屬性在各種環(huán)境因素（如溫度、凍融等）的影響下隨時(shí)間變化的規(guī)律，是產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品有效期（或中間樣品暫存期）制定的重要依據(jù)。同時(shí)，也可用于判定工藝參數(shù)、制劑處方、包裝材料等是否合理。

       （一）基本原則和貯存穩(wěn)定性研究

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品可參照一般生物制品穩(wěn)定性研究的要求，并根據(jù)產(chǎn)品自身的特點(diǎn)、臨床用藥的需求，以及包裝、貯存和運(yùn)輸?shù)那闆r設(shè)計(jì)合理的研究方案。

       研究用樣品：依據(jù)特定生產(chǎn)工藝的需要和相應(yīng)細(xì)胞的可獲得性，選擇代表性樣本開展研究，包括采集的起始細(xì)胞、生產(chǎn)過程中間樣品、細(xì)胞成品、臨床使用過程中樣品等，研用樣品的生產(chǎn)、使用和質(zhì)量（如總細(xì)胞密度和體積范圍等） 應(yīng)可代表實(shí)際情況。樣品的包裝容器與密封系統(tǒng)應(yīng)選擇與實(shí)際貯存相同或同材質(zhì)的小規(guī)格包裝容器與密封系統(tǒng)。對于自體免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品，如患者細(xì)胞使用受限時(shí)，可采用經(jīng)評估具有代表性的健康供者細(xì)胞開展研究。

       考察條件：根據(jù)產(chǎn)品在貯存、運(yùn)輸和使用過程中的實(shí)際情況和可能的暴露條件選擇合理、全面的穩(wěn)定性考察條件。例如，對于需冷凍貯存的細(xì)胞成品、起始細(xì)胞或中間樣品， 需研究其在冷凍和復(fù)蘇條件下細(xì)胞質(zhì)量（如細(xì)胞數(shù)量、活率、外觀完整性、功能等）的變化情況；需要時(shí)，還可研究多次凍融的影響。此外，可根據(jù)產(chǎn)品在貯存、運(yùn)輸、使用中可能暴露的劇烈條件，開展如高溫、輻照、振蕩等影響因素研究。

       檢測指標(biāo)和檢測方法：通常結(jié)合產(chǎn)品特性，設(shè)定合理、全面的檢測指標(biāo)，包括但不限于理化特性、細(xì)胞活率、目的細(xì)胞比例、生物學(xué)活性、微生物安全性指標(biāo)等。研究需合理設(shè)置各項(xiàng)指標(biāo)的考察頻次，如至少在擬定有效期的初期和末期進(jìn)行無菌試驗(yàn)或替代試驗(yàn)（如容器/密封系統(tǒng)的完整性試驗(yàn)）。若穩(wěn)定性數(shù)據(jù)提示輔料在有效期內(nèi)可能發(fā)生氧化、降解等對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不良影響時(shí)，有必要在穩(wěn)定性試驗(yàn)中對輔料含量或相關(guān)活性加以監(jiān)測。所用的檢測方法應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證研究，可靈敏地反映產(chǎn)品穩(wěn)定性變化趨勢。

       （二）運(yùn)輸穩(wěn)定性研究

       免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品通常要求冷鏈運(yùn)輸，對產(chǎn)品的運(yùn)輸過程應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的穩(wěn)定性模擬驗(yàn)證研究。穩(wěn)定性研究需充分考慮運(yùn)輸路線、交通工具、距離、季節(jié)、時(shí)間、條件（如溫度、輻射、振動(dòng)情況等）、產(chǎn)品包裝情況（如外包裝、內(nèi)包裝等）、產(chǎn)品放置情況和監(jiān)控器情況（如溫度監(jiān)控器的數(shù)量、位置等） 等各方面因素，建議模擬實(shí)際運(yùn)輸?shù)淖畈顥l件開展研究。對于懸浮在液體中保存的細(xì)胞成品、起始細(xì)胞或中間樣品，需要在研究中關(guān)注產(chǎn)品的放置方向（如正立、倒立或水平放置等）和振蕩對細(xì)胞的影響。通過運(yùn)輸穩(wěn)定性研究，確認(rèn)產(chǎn)品在運(yùn)輸過程擬定的貯存條件下可以保持產(chǎn)品的穩(wěn)定性。并建議評估產(chǎn)品在短暫的脫離擬定貯存條件（如產(chǎn)品脫離冷鏈的溫度、次數(shù)、總時(shí)間等）對產(chǎn)品質(zhì)量的影響。

       （三）使用穩(wěn)定性研究

       使用穩(wěn)定性研究設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)考慮臨床實(shí)際使用的場景對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，如注射器及針頭種類、抽吸與推注及滴注的速率、靜脈滴注的輸液管道種類、輸注壓力，以及給藥環(huán)境條件（如溫度、光照等）和時(shí)間等。對于在使用過程中需要復(fù)蘇、稀釋、混合和/或暫存的樣品，需開展研究來支持產(chǎn)品在使用貯存期的穩(wěn)定性。使用穩(wěn)定性研究中，還需關(guān)注操作過程中引入微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)使用穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)合理擬定產(chǎn)品解凍或臨床配伍后的放置條件和時(shí)間。

       （四）貯存條件標(biāo)識

       根據(jù)穩(wěn)定性研究結(jié)果，需在產(chǎn)品說明書和/或標(biāo)簽中明確產(chǎn)品的貯存條件和有效期。不能冷凍的產(chǎn)品需另行說明。若產(chǎn)品要求防輻射或避免凍融等，建議在各類容器包裝的標(biāo)簽和說明書中注明。

       九、包裝及密封容器系統(tǒng)

       為避免生產(chǎn)過程中接觸樣品的材料、存儲容器和包裝材料對免疫細(xì)胞治療產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生非預(yù)期影響，需對其進(jìn)行安全性評估、相容性研究和功能適用性研究。

       安全性評估方面，需對材質(zhì)成分及其來源、生產(chǎn)工藝過程可能引入的風(fēng)險(xiǎn)（如適用）和質(zhì)量控制等進(jìn)行充分的安全性評估?？刹捎霉?yīng)商對包裝材料進(jìn)行的基本性能測試和生物安全性評估等結(jié)果作為參考依據(jù)。

       相容性研究方面，其基本原則可參照一般生物制品包材相容性研究的要求?；陲L(fēng)險(xiǎn)評估，可對直接接觸的材料或容器開展可提取物/浸出物研究，并進(jìn)行安全性評估。研究中需充分評估相容性風(fēng)險(xiǎn)較高的成分（如輔料 DMSO）與材料或容器的相互作用等。

       功能適用性方面，一般可考慮容器密閉性/密封性、冷凍適用性等方面的研究等。

       另外，對于運(yùn)輸用的次級包裝容器（非直接接觸細(xì)胞） 或材料也應(yīng)開展驗(yàn)證研究，研究的項(xiàng)目包括但不限于保溫性、密封性、抗機(jī)械壓力和遮光性（如需要）等方面。