藥物研發(fā)領(lǐng)域小白，對藥物研發(fā)曲折歷程有濃厚興趣，愿與諸君共同學習。

       摘要

       伊馬替尼的上市開創(chuàng)了靶向藥物分子治療的新領(lǐng)域，但是“道高一尺，魔高一丈”，伊馬替尼的反復(fù)服用，容易刺激Bcr-Abl激酶發(fā)生變異，這也是白血病細胞產(chǎn)生伊馬替尼抗性的主要原因，盡管格列衛(wèi)（伊馬替尼）耐藥期相對較長，但是，只要患者服用，總有一天會耐藥的。

       那么，對于治療耐受伊馬替尼的慢性粒細胞白血?。–ML）患者怎么辦呢？帕納替尼（ponatinib）將是最 好的選擇！

       帕納替尼雖然上市晚于伊馬替尼10年，卻是針對伊馬替尼耐藥的患者，其研發(fā)過程做到了精雕細刻的考察、反復(fù)地驗證，整個過程是嚴謹?shù)?、是艱辛的，研發(fā)的源頭性和路徑上也具有獨立和獨創(chuàng)的品格。

       01、源于骨質(zhì)疏松藥物的研究

       帕納替尼開始的研究并沒有借鑒和模擬伊馬替尼的思路，而是源于研究骨質(zhì)疏松藥物。實驗證明，Src過表達可引起骨質(zhì)疏松，Src基因敲除小鼠可避免骨質(zhì)疏松的發(fā)生?；诖?，ARIAD公司以Src激酶為靶標研制抗骨質(zhì)疏松藥物。選擇嘧啶并吡咯和嘧啶并吡唑類化合物作為篩選苗頭，源于諾華和輝瑞公司曾報道過這類化合物具有活性。ARIAD發(fā)現(xiàn)化合物1抑制Src激酶IC50值40 nmol·L-1, 進而變換結(jié)構(gòu)，化合物2和3的IC50值分別為4 nmol·L-1和20 nmol·L-1。

       在研究上述內(nèi)容的同時，ARIAD還啟動了以依賴周期蛋白激酶(CDK)為靶標，研發(fā)抗骨質(zhì)疏松的課題。2,6,9-三取代嘌呤化合物purvalanol A(4)是CDK強效抑制劑?；衔?抑制CDK2的活性IC50高達70nmol·L-1，但抑制與骨質(zhì)疏松相關(guān)的Src激酶活性不高，IC50=0.24μmol·L-1，由此設(shè)計合成了在嘌呤2,6,9-位變換不同取代的化合物。

       將化合物4中2位的異丙基去除后，活性降低6倍；再將9位的異丙基換成間羥基苯乙基，活性提高60倍，這提示9位為大片段有利于同靶標的結(jié)合。6位的氯苯基去除氯原子后活性幾乎不變，但是2位烷胺基換成環(huán)戊基時活性略有下降，而6位的苯環(huán)對位連接氧化膦基或亞甲二膦酸基時，對Src激酶抑制活性顯著提高，其中化合物9活性最 高，IC50=0.45nmol·L-1，代號為AP23464，為里程碑式化合物。

       02、轉(zhuǎn)向研究CML的雙重抑制劑

       持續(xù)服用伊馬替尼引起的耐藥性是由于激酶的突變，除了Abl變異之外，Src 酪氨酸激酶家族的Lyn、Hck和Lyn等也發(fā)生突變， ARIAD進而以耐藥的CML為目標，研究對Src/Abl雙靶標抑制的藥物。

       化合物9對兩個激酶Src/Abl的抑制作用IC50都低于1 nmol·L-1， 根據(jù)化合物9與Src晶體結(jié)構(gòu)信息，認為將亞乙基的柔性連接基剛性化，以固定末端苯環(huán)的取向，應(yīng)能提高活性。用分子對接方法將N9連接的乙苯基變換成trans-乙烯苯10，由于雙鍵的定向作用，使苯基結(jié)合于激酶突變后產(chǎn)生的特異性疏水腔。同時也合成了cis-乙烯苯11以驗證對接結(jié)果。進而模仿達沙替尼的結(jié)構(gòu)片段，合成了trans-乙烯2,6-二甲苯基化合物12和cis-乙烯2,6二甲苯基13，抑制酶和細胞的活性進一步提高。然而，化合物10和12對Src和Abl抑制活性相差較大, 為提高對Abl激酶的活性，將二丙膦氧基片段換為體積較小的二甲基化合物14，拉近了對Src和Abl的活性，為此固定二甲基膦氧基不變，變換N9乙烯基連接的芳環(huán)。

       03、另一路徑—設(shè)計DFG-out構(gòu)象的抑制劑

       上述以化合物9為先導(dǎo)物所優(yōu)化的雙重抑制劑，N9連接的片段所結(jié)合的位點是活化環(huán)套的DFG呈與ATP結(jié)合的狀態(tài)，即結(jié)合于DFG-in構(gòu)象的抑制劑。同時進行的另一途徑是合成激酶的活化環(huán)套呈DFG-out構(gòu)象的抑制劑，猶如伊馬替尼結(jié)合樣式。Abl激酶與抑制劑的晶體結(jié)構(gòu)表明，當活化環(huán)套呈DFG-out構(gòu)象時，抑制劑N9連接的二芳酰胺片段與酶形成了氫鍵網(wǎng)絡(luò)，故而設(shè)計了化合物15。

       3.1 C6取代基的變換

       活性評價結(jié)果證實，化合物15對Src和Abl都有較高活性，而且在10 μmol·L-1濃度下對正常細胞無作用，提示有高選擇性。大鼠藥代動力學實驗表明15的口服利用度F=20%，半衰期很短，是由于C6的甲胺基發(fā)生氧化去甲基作用。故而合成了環(huán)丙基化合物16(環(huán)丙基代謝穩(wěn)定性高于甲基)，仍保持了酶和細胞活性，而改善了藥代，F(xiàn)=40%，血漿中有高暴露量。環(huán)丙基的親脂性強于甲基，推論進一步增高親脂性會有利于活性。為此合成了芳環(huán)17～22，吡啶和嘧啶化合物活性都很高，但2-吡啶基化合物17卻很低，可能是由于2'-N與嘌呤N1的電性排斥作用，芳環(huán)扭轉(zhuǎn)，破壞了共面性，而18和19沒有排斥作用(但嘧啶也有鄰位排斥作用，活性下降卻不明顯)?；衔?1移植了9的模塊，Scr和Abl活性都比較高。22的活性很弱。然而這些高活性化合物的大鼠藥代都不好，因而將C6-環(huán)丙胺基固定做進一步優(yōu)化。

       3.2 N9連接片段的變換——借鑒尼洛替尼的設(shè)計

       優(yōu)化N9位置，借鑒了諾華的尼洛替尼的設(shè)計理念，合成了脲基和反向酰胺連接的化合物23和24。23幾乎沒有活性，而24的-CONH-比區(qū)域異構(gòu)體16的-NHCO-活性強，猶如尼洛替尼活性強于伊馬替尼。為此，以24為新起點，優(yōu)化末端芳環(huán)。構(gòu)效關(guān)系表明，在三氟甲苯基環(huán)上再加入鹵素(25、26)活性減弱，三氟甲基換成叔丁基(27)，對Src活性提高一倍多，但抑制Abl作用降低，提示這兩種激酶結(jié)合腔的差異。化合物28為異丙基，都比叔丁基弱。然而27親脂性過強，clogP=6.76，超過化合物24，綜合考慮27不可取。含叔丁基的芳雜環(huán)化合物中異噁唑29對Scr和Abl都很強，但大鼠藥代不如24。化合物30的活性優(yōu)于24，而且親脂性比24降低10倍。有趣的是，將上市藥物尼洛替尼的“大塊片段”連接在酰胺上，化合物31活性非常高，說明該優(yōu)化的模塊適用于本系列中，也意味著與激酶結(jié)合的相似性。

       3.3 連接基乙烯基的變換

       持續(xù)應(yīng)用伊馬替尼可引起Abl激酶發(fā)生變異(AblT315I)，即門戶殘基Thr315 突變Ile315，T315I突變的后果。氨基酸側(cè)鏈由CH(CH3)OH變成CH(CH3)CH2CH3，不僅體積變大，空間上也阻礙了伊馬替尼的進入，而且失去形成氫鍵的能力(羥基O為氫鍵接受體)?；衔?1對AblT315I激酶有中等強度的活性，提示該系列化合物的結(jié)構(gòu)特征對門戶殘基的Abl變異仍可結(jié)合。進而設(shè)想將乙烯基換成直線型的乙炔基更能解除位阻效應(yīng)。為此將乙烯基和乙炔基與有強結(jié)合作用的芳環(huán)進行組合優(yōu)化。

       化合物33與32比較(同樣35與34相比)雖然對未變異的Abl的活性相近，但對變異的激酶活性(AblT315I)提高了30～40倍，這些結(jié)果說明乙炔基是優(yōu)化的連接基。然而化合物33和35的藥代動力學性質(zhì)不佳，且很容易被代謝消除，須進一步優(yōu)化。

       3.4 骨架遷越——更換嘌呤環(huán)

       嘌呤和苯環(huán)之間的連接基是N-C≡C-C的炔胺結(jié)構(gòu)時，化學和藥動學不如C-C≡C-C穩(wěn)定，故試圖變換嘌呤環(huán)結(jié)構(gòu)，合成一系列新的化合物。

       化合物36和37對Abl的抑制活性很高，證明了骨架躍遷的成功，但是大鼠的藥代動力學不佳，可能是由于嘌呤環(huán)上的氨基或乙酰氨基導(dǎo)致的，故去掉氨基后，化合物38保持了對變異酶的活性，而且改善了大鼠藥代，口服利用度42%。但Abl的活性弱于36和37。在咪唑環(huán)上加入助溶基團后，39和40的活性仍不高，還得以新的途徑優(yōu)化活性。

       3.5增加與活化環(huán)套的結(jié)合——模擬伊馬替尼的結(jié)構(gòu)設(shè)計

       在已有優(yōu)化的基礎(chǔ)上再提高與AblT315I酶的結(jié)合作用，探索增加與活化環(huán)套(A-loop)的殘基結(jié)合。

       合成化合物41的活性結(jié)果表明，對AblT315I激酶活性比38提高2倍，Abl提高20倍，而且在高濃度(340 μmol·L-1)人血漿白蛋白存在下對白血病細胞抑制活性并不減弱，提示與血漿蛋白結(jié)合的較少，因而成為一個很好的突破口。若將哌嗪片段移至5位，活性減弱，提示位置的重要性。下一步優(yōu)化堿性片段都在苯環(huán)的4位。

       變換堿基片段的活性結(jié)果表明，化合物41的哌嗪N4被氧原子替換，嗎啉化合物42活性顯著減弱，佐證了N4形成氫鍵的重要性。43和44分別為縮環(huán)和擴環(huán)化合物，雖然也存在類似于哌嗪N4的氮原子，但這兩個化合物的活性弱于41，將41的N-CH3換成較大的烷基或氟(或羥)乙基(48、49)都不利于抑制突變株。

       3.6母核吡咯并吡啶的再檢討

       當初去除氨基以改善藥代效果時，雖然損失了一些活性（權(quán)衡結(jié)果劃算），現(xiàn)為了彌補損失，合成了一系列增加雜環(huán)內(nèi)的NH的衍生物，以提供氫鍵給體。

       化合物52～55的活性表明，52和55對變異激酶的活性略有提高，但是53和54的活性降低。另一思路是，為了降低41的親脂性(clogP=6.69)，在吡唑并吡啶環(huán)的不同位置加入一個氮原子(加一氮原子分配系數(shù)降低1個對數(shù)單位)，化合物57和58活性顯著提高，尤其是57。56的低活性是由于雜環(huán)的8位是用氫鍵接受體占據(jù)了氫鍵給體的位置，從而發(fā)生互相排斥的緣故。58的大鼠藥代優(yōu)于57，下一步是對母核換作咪唑并吡啶后的繼續(xù)優(yōu)化。

       3.7 新骨架的各取代基的綜合調(diào)整

       以58為新一輪優(yōu)化的起點，在苯環(huán)A的2位變換甲基，苯環(huán)B的3,4位變換三氟甲基和堿基，對結(jié)構(gòu)進行微調(diào)。

       得出還是化合物58的活性最 佳。

       3.8候選化合物的藥代性質(zhì)

       化合物58勝出為候選化合物，與各個里程碑化合物作了藥代動力學比較， 58大鼠灌胃的生物利用度18%，半衰期11h，靜脈注射的清除率0.65 L·h-1·kg-1。58定名為帕納替尼(ponatinib)，臨床前和臨床實驗，表明對慢性粒細胞白血病和費城染色體陽性的急性白血病有效，于2012年經(jīng)美國FDA批準上市。

       小結(jié)

       帕納替尼是一個線型分子，它的研制涉及了整個分子所有的基團和片段的優(yōu)化，雖然同類產(chǎn)品伊馬替尼在它10年前面市，也在設(shè)計上有所借鑒，但仍不失為創(chuàng)新性 藥物。在分子設(shè)計?合成?評價?構(gòu)效關(guān)系分析的循環(huán)反饋中，結(jié)構(gòu)生物學、分子模擬和藥物化學的交織應(yīng)用與印證，對結(jié)構(gòu)的各個側(cè)面做到了精雕細刻的考察，甚至是反復(fù)地驗證。

       參考資料

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       2. Sundaramoorthi R, Shakespeare WC, Keenan TP, et al. Bonetargeted Src kinase inhibitors: novel pyrrolo-and pyrazolopyrimidine analogues. Bioorg Med Chem Lett, 2003, 13: 3063-3066

       3. Wang W, Metcalf CA, III, Shakespeare WC, et al. Bonetargeted 2, 6, 9-trisubstituted purines: novel inhibitors of Src tyrosine kinase for the treatment of bone diseases. Bioorg Med Chem Lett, 2003, 13: 3067-3070

       4. Huang WS, Zhu X, WangY, et al. 9-(Arenethenyl) purines as dual Src/ABL kinase inhibitors targeting the inactive conformation: design, synthesis, and biological evaluation. J Med Chem, 2009,52: 4743-4756

       5. Huang WS, Metcalf CA, Sundaramoorthi R, et al. Discovery of 3- [2- (imidazo[1,2-b] pyridazin-3-yl)ethynyl]-4-methyl-N-{4-[(4-methylpiperazin-1-yl)- methyl]-3-(trifluoromethyl)phenyl}benzamide(AP24534), a potent, orally active pan-inhibitor of breakpoint cluster region -abelson (BCR - ABL) kinase including the T315I gatekeeper mutant. J Med Chem, 2010, 53: 4701-4719