嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)修飾的T細(xì)胞治療在治療血液腫瘤領(lǐng)域取得令人欣喜的治療效果，尤其是抗CD19 CART細(xì)胞在治療B細(xì)胞惡性腫瘤患者時(shí)顯著提高了其臨床結(jié)局?？笴D19和抗CD20 CART在治療復(fù)發(fā)難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病B-ALL和非霍奇金淋巴瘤NHL的臨床試驗(yàn)中已廣泛開展，并顯示出了一定的有效性。然而，CART治療過程中，患者也出現(xiàn)了一些不良反應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放綜合征CRS，對(duì)于靶脫瘤**、神經(jīng)**和腫瘤溶解綜合征TLS，需要謹(jǐn)慎處理。隨著CART治療患者的增加，一些潛在的**也逐漸顯現(xiàn)。

       在一個(gè)臨床研究(NCT01864889)中，發(fā)現(xiàn)1例復(fù)發(fā)難治CD19+彌漫大B淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)患者接受CD19 CART治療后，體內(nèi)T細(xì)胞過度活化和增殖。輸注后13天，外周血中淋巴細(xì)胞數(shù)達(dá)到77×109/L，CD8+活化T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例達(dá)到93.06%?；颊叱霈F(xiàn)了發(fā)熱和缺氧，血清中細(xì)胞因子、乳酸脫氫酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等水平顯著升高。基于臨床數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，排除了T細(xì)胞白血病，未發(fā)現(xiàn)過度T細(xì)胞增殖是CD19抗原依賴的。

       通過對(duì)該患者T細(xì)胞受體TCR的高通量測(cè)序和全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，TCR具有多樣性，但并沒有與T細(xì)胞增殖有關(guān)的特異的基因突變。另外，該患者有JC病毒(John Cunningham polyomavirus，JCV)感染。因?yàn)椴《菊T導(dǎo)的非特異型號(hào)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，不能排除JC病毒感染通過旁路途徑對(duì)免疫系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致T細(xì)胞過度活化和增殖。在進(jìn)行CART治療時(shí)應(yīng)事先考慮細(xì)胞輸注后在體內(nèi)不受控制地活化和增殖的風(fēng)險(xiǎn)，提前制定相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制措施，對(duì)該患者的分析將有助于同類產(chǎn)品臨床試驗(yàn)安全性風(fēng)險(xiǎn)的控制。

       案例信息

       這是一名29歲的亞洲男性，接受CART治療前7個(gè)月被診斷為CD19+DLBCL IIIB期，接受了6個(gè)周期的治療，包括2個(gè)周期的R-CHOP，2個(gè)周期的R-EPOCH，1個(gè)周期的R-GDP，以及1個(gè)周期的Hyper-CVAD，均未獲得完全緩解。納入CART臨床試驗(yàn)前，進(jìn)行了FDG-PET/CT掃描，顯示右腋下病灶的淋巴瘤進(jìn)展。病灶約為4×5 cm，SUVmax是23，其他身體區(qū)域未發(fā)現(xiàn)病灶。白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常，WBC 5.58×109/L，淋巴細(xì)胞20.1%，中性粒細(xì)胞72.4%，骨髓未受累。采集該患者的外周血單核細(xì)胞PBMC，進(jìn)行CD19 CART的生產(chǎn)。CD19 CART的激活域是CD3ζ，共刺激域是CD137(41BB)，采用慢病毒載體。在環(huán)磷酰胺(30 mg/kg，共3天)和氟達(dá)拉濱(25 mg/m2，共3天)預(yù)處理后，患者分3天接受了CD19CART(總劑量為2.53×106個(gè)/kg)。轉(zhuǎn)染效率是74.5%。

       輸注后患者較為耐受，未立即出現(xiàn)**。但在輸注后第8天，外周血中CD19+B細(xì)胞顯著下降，伴隨著CAR拷貝數(shù)顯著升高。輸注后1周，B超檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病灶減小至1 cm。輸注后3周CT掃描與基線相比，病灶幾乎消失。

**

       CART細(xì)胞輸注后7天出現(xiàn)不良事件，包括發(fā)熱(39.3℃)、寒戰(zhàn)、皮疹。血清中一些細(xì)胞因子和C反應(yīng)蛋白CRP水平迅速升高，包括顆粒酶A、顆粒酶B、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12p70、IFN-γ、IFN-β。實(shí)驗(yàn)室生化檢測(cè)結(jié)果顯示，輸注后第9天，乳酸脫氫酶LDH和AST水平顯著升高。ALT和γ-GT的峰值出現(xiàn)在第14天，考慮該患者發(fā)生了CRS，因此，給予了妥珠單抗(8 mg/kg，用藥1天)和甲強(qiáng)龍(2 mg/kg，用藥3天)。第11天，患者體溫恢復(fù)正常，患者的轉(zhuǎn)氨酶水平逐漸下降，CRS得到控制。第18天，患者體溫低2次達(dá)到峰值，IL-6、IFN-γ、CRP水平升高，再次給予妥珠單抗(8 mg/kg，用藥1天)。

       然而，出人意料的是，第13天，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)迅速升高到77×109/L。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示93.06%的淋巴細(xì)胞是CD3+和CD8+T細(xì)胞，CD8+CD28+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例從18%升高到90%，CD4+T細(xì)胞比例下降到非常低的水平，NK細(xì)胞(CD16+CD56+)幾乎消失。分泌IFN-γ和顆粒酶的CD3+CD8+IFN-γ+和CD3+CD8+GrB+ 細(xì)胞高于基線水平。第17天，患者血氧過低，第18天，患者出現(xiàn)彌漫性肺滲出。皮疹的病理結(jié)果顯示真皮層有T細(xì)胞，為避免白細(xì)胞淤積，第13和14天給予患者小劑量環(huán)磷酰胺(10 mg/kg)進(jìn)行治療，隨后，白細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸下降。第34天，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)又開始升高，因此又給予環(huán)磷酰胺(10 mg/kg，2天)，環(huán)磷酰胺劑量較小，不會(huì)誘導(dǎo)粒細(xì)胞缺乏。輸注后第12天，患者的中性粒計(jì)數(shù)幾乎為0，意味著患者粒缺將近20天。由于淋巴細(xì)胞迅速增殖，對(duì)粒細(xì)胞增殖造成抑制。第38天，由于患者出現(xiàn)寒戰(zhàn)和高熱，進(jìn)行了血培養(yǎng)檢測(cè)。培養(yǎng)3天后，發(fā)現(xiàn)了亞胺培南抵抗的不動(dòng)桿菌屬的鮑曼不動(dòng)桿菌，雖然使用了多種抗生素的聯(lián)合治療，患者最終由于敗血性休克死亡。

       輸注后1天，對(duì)外周血和單核細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分析結(jié)果初步顯示，大量的未成熟淋巴細(xì)胞，90%是有核細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，T細(xì)胞受體并非單一克隆，而是多樣的。為確認(rèn)TCR的多樣性，進(jìn)行了深度測(cè)序，結(jié)果顯示樣本中含有11030個(gè)不同克隆，另外，13個(gè)克隆比例占到1%以上，然而，無優(yōu)勢(shì)克隆或T細(xì)胞克隆，核型分析也未發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病，因此，T-ALL引起的T細(xì)胞過度增殖可以被排除。

       為進(jìn)一步分析T細(xì)胞過度增殖的原因，進(jìn)行了二代深度測(cè)序，結(jié)果也未發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞增殖相關(guān)的突變。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有病毒DNA，且是JC病毒陽性。該病毒在免疫功能不全的人體內(nèi)會(huì)再激活，引起嚴(yán)重致命的反應(yīng)。

討論

       T細(xì)胞存活受到T細(xì)胞受體TCR、共刺激分子(包括CD28)、黏附分子、細(xì)胞因子(如IL-2、IL-13、IL-15)、其他凋亡因子、抗凋亡因子的影響。在CAR+T細(xì)胞中，細(xì)胞的激活和增殖是特異抗原依賴的。在本文案例中，細(xì)胞輸注后4天，CD19+B細(xì)胞水平仍然較低。由于淋巴結(jié)病灶消失，無法進(jìn)行活檢，也無從獲知淋巴結(jié)是否表達(dá)CD19，不能排除病灶中CD19抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，然而，這種可能性很小。

       載體DNA整合到宿主細(xì)胞引起插入突變的風(fēng)險(xiǎn)較低，但是一旦發(fā)生十分危險(xiǎn)。有文獻(xiàn)報(bào)道，在兩名年輕患者基因治療后3年，LMO2位點(diǎn)的插入突變引起T細(xì)胞不受控制的增殖，CD3+T細(xì)胞達(dá)到100×109/L。然而，本案例的一系列流式細(xì)胞儀結(jié)果、測(cè)序結(jié)果和核型分析結(jié)果排除了這一可能。

       有報(bào)道稱，在病毒感染存在時(shí)，非特異和抗原特異刺激均能引起CD8+T細(xì)胞增殖。本案例中，檢測(cè)到JC病毒的存在。通過測(cè)序結(jié)果顯示，患者中CD8+T細(xì)胞不是JC病毒特異的。排除了病毒相關(guān)抗原引起的T細(xì)胞增殖。但病毒感染引起的旁路激活途徑不能忽視，T細(xì)胞可以被旁路激活途徑刺激增殖，例如病毒感染產(chǎn)生大量細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放，引起炎性微環(huán)境。體外實(shí)驗(yàn)證明許多細(xì)胞因子可以刺激CD8+T細(xì)胞增殖，如TNF-α、IL-2、IFN-α/β、IL-12、IL-15、IL-18。該患者發(fā)生CRS時(shí)，許多細(xì)胞因子急劇升高，然而目前還沒有發(fā)生CRS的患者引起T細(xì)胞增殖的報(bào)道。

       由于CART治療血液腫瘤療效顯著，多家醫(yī)院正在開展或?qū)⒁_展該療法。除大家熟知的CRS、神經(jīng)**等CART治療相關(guān)不良事件外，T細(xì)胞過度活化和增殖對(duì)患者的生命造成很大威脅。在使用該療法時(shí)應(yīng)充分評(píng)估其安全性，做好相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)控制方案。

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