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CPHI制藥在線 資訊 清華大學(xué)陳春來(lái)/劉俊杰團(tuán)隊(duì)揭示CasX靶標(biāo)搜索和切割過(guò)程的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制

清華大學(xué)陳春來(lái)/劉俊杰團(tuán)隊(duì)揭示CasX靶標(biāo)搜索和切割過(guò)程的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制

熱門(mén)推薦： CRISPR-Cas 靶點(diǎn) 免疫系統(tǒng)
作者：BW  來(lái)源：生物世界
  2024-07-15
CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古菌中對(duì)抗外源核酸入侵的獲得性免疫系統(tǒng)?；贑RISPR-Cas系統(tǒng)在RNA引導(dǎo)下靶向DNA的功能，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種被廣泛使用的基因編輯和調(diào)控工具。

       CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古菌中對(duì)抗外源核酸入侵的獲得性免疫系統(tǒng)?；贑RISPR-Cas系統(tǒng)在RNA引導(dǎo)下靶向DNA的功能，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種被廣泛使用的基因編輯和調(diào)控工具。

       CasX（又稱(chēng)Cas12e）屬于第2類(lèi)CRISPR-Cas系統(tǒng)，因其體積較小，相較于廣泛使用的Cas9和Cas12a蛋白更便于遞送到細(xì)胞內(nèi)，展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。但除了共有的RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域外，CasX與Cas12a和Cas9在蛋白序列上相似性甚微。此外，CasX獨(dú)有的NTSB結(jié)構(gòu)域，對(duì)于其切割活性至關(guān)重要。這些不同之處暗示了CasX可能具有獨(dú)特的靶向和切割機(jī)制。

       2024年7月12日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/北京生物結(jié)構(gòu)前沿研究中心陳春來(lái)課題組與劉俊杰課題組合作，在 Nucleic Acids Research 期刊發(fā)表了題為：Conformational dynamics of CasX (Cas12e) in mediating DNA cleavage revealed by single-molecule FRET 的研究論文。

       該論文細(xì)致表征了CasX從非特異性結(jié)合到找到靶點(diǎn)并完成切割的動(dòng)態(tài)過(guò)程，揭示了其獨(dú)特的機(jī)制。

Conformational dynamics of CasX (Cas12e) in mediating DNA cleavage revealed by single-molecule FRET 研究論文

       利用供體（Cy3）標(biāo)記的sgRNA和受體（Cy5）標(biāo)記的DNA，研究者通過(guò)單分子FRET實(shí)驗(yàn)捕捉到CasX蛋白在切割過(guò)程中依次呈現(xiàn)的3種構(gòu)象狀態(tài)：R-loop起始狀態(tài)、R-loop形成后非靶標(biāo)鏈（NTS）切割狀態(tài)和靶標(biāo)鏈（TS）切割狀態(tài)（圖1）。此外，還定量分析了sgRNA與DNA的匹配度如何影響CasX在DNA上的穩(wěn)定性和切割活性，為基于CasX的基因編輯和調(diào)控工具的設(shè)計(jì)提供了重要依據(jù)。DpbCasX和PlmCasX在切割特異性上的差異，源于它們?cè)诮Y(jié)合DNA及切割過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)差異；而兩者在切割過(guò)程中FRET模式的不同，則歸因于它們?cè)贒NA上切割位點(diǎn)的差異。

DpbCasX結(jié)合及切割全匹配DNA的構(gòu)象動(dòng)態(tài)

圖1. DpbCasX結(jié)合及切割全匹配DNA的構(gòu)象動(dòng)態(tài)

       在本文中，研究者還提出了“有效靶標(biāo)搜索效率”這一新的概念，用以衡量Cas蛋白在接觸靶標(biāo)后的有效識(shí)別效率。數(shù)據(jù)顯示，CasX的有效靶標(biāo)搜索效率（僅10%）遠(yuǎn)低于Cas9和Cas12a（50%-80%）。這意味著，CasX需要嘗試約10次才能成功識(shí)別靶標(biāo)位點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜環(huán)境可能進(jìn)一步降低其搜索效率，從而導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)較低的編輯活性。這一發(fā)現(xiàn)為未來(lái)優(yōu)化CasX以及其他Cas蛋白提供了新視角。
       最后，研究者構(gòu)建了CasX識(shí)別與切割DNA的動(dòng)態(tài)模型（圖2）。CasX在搜尋靶點(diǎn)時(shí)與DNA短暫非特異性結(jié)合（Nonspecific binding），在動(dòng)態(tài)搜索過(guò)程中識(shí)別PAM序列（PAM recognition），開(kāi)始形成R-loop結(jié)構(gòu)（R-loop initiation），然而，相較于SpCas9、AsCas12a和LbCas12a， CasX在這一步的效率低5-8倍。識(shí)別PAM后，CasX依賴(lài)充足的PAM近端匹配驅(qū)動(dòng)R-loop形成，并利用單一的RuvC結(jié)構(gòu)域活性中心依次切割NTS和TS（R-loop formation and NTS cleavage，TS cleavage），最后釋放切割產(chǎn)物（DNA fragment release）。CasX獨(dú)特的NTSB結(jié)構(gòu)域在DNA解旋和R-loop形成中發(fā)揮了重要功能。這一動(dòng)態(tài)模型深化了我們對(duì)CasX工作機(jī)制的理解，并為CasX以及其他Cas蛋白的優(yōu)化和改造提出了新的思路和策略。
      
CasX結(jié)合和切割DNA的動(dòng)態(tài)模型

圖2. CasX結(jié)合和切割DNA的動(dòng)態(tài)模型

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