作為一種重要的藥物模態(tài)，寡核苷酸的開發(fā)領(lǐng)域在未來幾年將持續(xù)加強拓展。寡核苷酸藥物是一類由短核苷酸序列（DNA和RNA的組成部分）組成的治療藥物，它的進步引導(dǎo)了基因表達控制的新機制，通過藥物控制對基因表達水平，抑制致病蛋白的生成。

        寡核苷酸藥物開發(fā)流程：

        01 靶標識別

        寡核苷酸藥物靶向那些參與疾病過程的特定基因、信使RNA（mRNA）或非編碼 RNA（例如microRNA）。靶標識別是開發(fā)這些藥物的關(guān)鍵步驟。

        02 序列設(shè)計

        寡核苷酸藥物，從本質(zhì)上來說是依照靶標RNA來設(shè)計的，它的核苷酸序列與靶標RNA互補。這賦予了它們高度的結(jié)合特異性。

        03 與靶標RNA結(jié)合

        寡核苷酸藥物一旦進入體內(nèi)，就會在血液中循環(huán)，通過互補堿基配對選擇性地與目標RNA分子結(jié)合。這種親和作用可以通過多種機制發(fā)生：

• mRNA降解：一些寡核苷酸藥物能夠觸發(fā)靶標mRNA的降解。當這種寡核苷酸藥物與mRNA結(jié)合時，它可以招募細胞酶來降解RNA分子，阻止其翻譯成蛋白質(zhì)。

• 阻斷翻譯：某些寡核苷酸藥物可以物理阻礙核糖體的結(jié)合位點，或者干擾其他翻譯過程，阻斷mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。

• 剪接調(diào)節(jié)：如果寡核苷酸藥物的靶標是前信使RNA（Precursor mRNA），這些藥物可以影響選擇性剪接。通過與特定的剪接位點結(jié)合，它們可以促進特定外顯子的包含或排除，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)亞型的改變。

• RNA干擾(RNAi)：一些寡核苷酸藥物可以通過RNA干擾機制發(fā)揮藥效。它們被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC，RNA-induced silencing complex）中，并引導(dǎo)RISC尋找目標mRNA，導(dǎo)致其降解或翻譯抑制。

        04 對蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響

        通過調(diào)節(jié)靶標RNA，寡核苷酸藥物可以降低致病蛋白的產(chǎn)生水平。通常用于治療由蛋白質(zhì)生產(chǎn)過?；蛘吖δ苷系K引起的各種遺傳性疾病和罕見疾病。

        值得注意的是，寡核苷酸藥物在治療各種疾病方面顯示出光明的前景，包括：遺傳性疾病、神經(jīng)退行性疾病和某些類型的癌癥，尤其是在很多傳統(tǒng)上被認作“不可成藥”的靶標上，可以發(fā)揮關(guān)鍵的作用。然而，它們的開發(fā)可能很復(fù)雜，并且可能有局限性和潛在的副作用，在臨床使用中需要仔細考慮。

01

反義寡核苷酸

        反義寡核苷酸（ASO，Antisense oligonucleotides）是經(jīng)過化學(xué)修飾的單鏈DNA或RNA分子片段，長度通常為15-30個核苷酸，通過Watson-Crick堿基配對規(guī)則與內(nèi)源性mRNA靶標特異性結(jié)合。ASO包括反義RNA（asRNA）和反義DNA（asDNA）。

        從類藥性角度考慮，通常需要對反義寡核苷酸進行化學(xué)修飾，以保證生理條件下的穩(wěn)定性，增加抑制mRNA靶標的效力。

        ASO的作用機制包括：翻譯抑制、mRNA降解、剪接調(diào)節(jié)。它可以應(yīng)用在基因沉默，治療某些遺傳性疾病、癌癥和神經(jīng)退行性疾病之中。ASO在治療脊髓性肌萎縮癥（SMA）、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）和某些癌癥方面，顯示出良好的前景。例如，nusinersen（Spinraza）就是一種被批準用于治療SMA的ASO。

        1 硫代磷酸酯寡核苷酸

        硫代磷酸酯（Phosphorothioates）是寡核苷酸藥物最初的主鏈修飾方式。Fomivirsen（商品名Vitravene，圖1）是第一個被批準用于人類治療的反義寡核苷酸藥物。它是一種硫代磷酸酯寡核苷酸衍生物的抗病毒藥物，治療巨細胞病毒引起的視網(wǎng)膜炎，這種疾病出現(xiàn)在一些艾滋病患者中，如果不進行干預(yù)治療會導(dǎo)致患者失明。

        硫代磷酸酯的主鏈修飾，延長了寡核苷酸在血清中的半衰期，促進其與血清蛋白的結(jié)合，增加細胞攝取，指導(dǎo)核糖核酸酶H降解靶標mRNA。

圖1. Fomivirsen化學(xué)結(jié)構(gòu)（紅色部分為一個硫代磷酸酯結(jié)構(gòu)），來源：Wikipedia

        2 Aptamer（適配體）

        適配體既可以是單鏈DNA、RNA分子，也可以是多肽分子，它們具有獨特的三維結(jié)構(gòu)，能夠選擇性地結(jié)合特定的靶分子，例如蛋白質(zhì)、核酸、小分子，甚至細胞。適配體有時被稱為“化學(xué)抗體”，因為它們能夠以高特異性和親和力識別并結(jié)合其靶標。適配體與抗體相比具有多種優(yōu)勢，包括尺寸更小、易于合成以及修飾潛力。當在體內(nèi)使用時，它們通常也不會引起免疫反應(yīng)。

        就寡核苷酸來說，適配體是無毒且非免疫原性的單鏈DNA或RNA寡核苷酸，長度在 20至80個核苷酸之間。這些aptamer分子可能具有與抗體相似的結(jié)合親和力，并且可以大規(guī)模合成、修飾，以實現(xiàn)優(yōu)化藥代動力學(xué)特性。

        Pegaptanib（商品名 Macugen）是目前唯一被批準用于人類治療的aptamer（有幾種aptamer正在進行臨床試驗）。Pegaptanib分子中的寡核苷酸與聚乙二醇（PEG） 化學(xué)連接（圖2），用于治療新生血管（濕性）年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD），2004年12月獲得FDA批準。

圖2. Pegaptanib化學(xué)結(jié)構(gòu)

        Pegaptanib與血 管 內(nèi) 皮 生 長 因 子（VEGF）具有高親和力。Pegaptanib特異性結(jié)合 VEGF的165亞型，后者是一種在血管生成和滲透性增加（血管滲漏）中，發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)，這是兩個AMD的主要病理過程。Pegaptanib是VEGF的拮抗劑，注射到眼睛后會阻斷VEGF的作用，減少眼內(nèi)血管的生長，有助于控制滲漏和腫脹。

        3 Gapmer

        Gapmer技術(shù)代表了第二代寡核苷酸藥物。Gapmer是短DNA或RNA反義寡核苷酸，向寡核苷酸分子中，引入2'-O-烷基（以及其它修飾）結(jié)構(gòu)。這種修飾增加了反義寡核苷酸對核酸酶的穩(wěn)定性，不過這些衍生物不被核糖核酸酶H（RNAse-H酶）識別。這個問題可以被Gapmer技術(shù)化解：Gapmer分子的中央部分并未進行2'-O-烷基（或其他修飾基團）修飾，因此該部分可以保留與RNAse-H酶的高親和力，而它們的突出端可以通過2'-O-烷基修飾進行改性。

        Gapmer與目標RNA片段雜交，通過招募RNAse-H酶，通過其裂解作用來沉默該目標基因。由于遭修飾的RNA側(cè)翼區(qū)域提高了它對核酸酶降解的抵抗力，因此，gapmer與靶標的結(jié)合具有更高的親和力和生物活性（圖3）。Gapmer目前正在被開發(fā)用于治療多種癌癥、病毒和其他慢性遺傳性疾病。

圖3. Gapmer作用機制，來源：Wikipedia by Biomolenguofu

        Gapmer化學(xué)修飾增加它對核酸酶降解的穩(wěn)定性。經(jīng)過LNA、2'-OMe或2'-F修飾的堿基（圖4），衍生出天然RNA的化學(xué)類似物。這些修飾可以增強核酸的酶抗性、降低免疫原性并降低毒 性。Gapmers還可以產(chǎn)生對目標mRNA更高的親和力，這種高親和力減少了脫靶效應(yīng)、非特異性結(jié)合和不需要的基因沉默。

圖4. 涉及2'-位置的寡核苷酸化學(xué)修飾，來源：Chemistry Today

        Mipomersen（商品名Kynamro）是一種20個堿基的gapmer，抑制載脂蛋白B，于 2013年獲批通過。Mipomersen通過降低低密度脂蛋白來治療高脂血癥。Mipomersen分子中，核苷酸以硫代磷酸酯鍵連接，而不是傳統(tǒng)的磷酸二酯鍵；糖部分進行了2'-O-甲氧基乙基修飾（圖5）。這些修飾使藥物能夠抵抗核酸酶的降解，從而實現(xiàn)每周給藥一次的頻率。

圖5. Mipomersen化學(xué)結(jié)構(gòu)（修飾的核苷酸處于分子兩翼），來源：Wikipedia

        其他Gapmer包括：2018年獲批治療運甲狀腺素蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性的Inotersen（Tegsedi），以及2019年批準用于治療家族性乳糜微粒血癥綜合征的 Volanesorsen （Waylivra）。

        4 外顯子跳躍的RNA剪接調(diào)節(jié)劑寡核苷酸

        反義寡核苷酸也可以設(shè)計為與剪接區(qū)域互補的序列，用來治療遺傳性疾病。這個策略可以治療剪接缺陷的疾病，允許誘導(dǎo)外顯子排除或外顯子包含。

        在分子生物學(xué)中，外顯子跳躍是RNA剪接的一種形式，用于“跳過”遺傳密碼的錯誤外顯子部位。盡管外顯子跳躍導(dǎo)致了基因改變，但變化后的基因仍能形成截短的蛋白質(zhì)，而這個截短的蛋白質(zhì)仍然可以發(fā)揮生物學(xué)功能。

        基因由內(nèi)含子和外顯子組成。外顯子是DNA的一部分，包含生成蛋白質(zhì)的指令集。它們的片段周圍散布著內(nèi)含子非編碼區(qū)域。在蛋白質(zhì)制造之前去除內(nèi)含子，僅留下編碼外顯子區(qū)域。

        對于那些產(chǎn)生基因突變的外顯子，可以用ASO與前信使RNA中的突變位點結(jié)合，以誘導(dǎo)外顯子跳躍。ASO與突變的外顯子結(jié)合，因此當該基因從成熟的mRNA翻譯時，它會被“跳過”，從而恢復(fù)被破壞的基因閱讀框。這個過程產(chǎn)生了內(nèi)部缺失但主要功能仍然保留的蛋白質(zhì)。這種機制被用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥中。

        這個領(lǐng)域內(nèi)的寡核苷酸藥物包括Eteplirsen（Exondys 51），Nusinersen （Spinraza），Golodirsen （Vyondys 53），Vitolarsen （Viltepso），Casimersen（Amondys 45）。這些寡核苷酸經(jīng)過硫代磷酸酯鍵和2'-O-烷基-RNA（尤其是甲氧基乙基，MOE）的化學(xué)修飾。

        PMO（Phosphorodiamidate morpholino oligomers，磷酸二酰胺嗎啉低聚物）是一種重要的ASO修飾物。PMO是合成DNA類似物，能夠抑制基因表達。PMO的主鏈是嗎啉環(huán)，通過磷酸二酰胺鍵連接（圖6）。作為不帶電荷的核酸類似物，PMO通過 Watson-Crick堿基配對與目標mRNA的互補序列結(jié)合，通過空間封鎖來阻止蛋白質(zhì)翻譯。PMO對生物體液中存在的多種酶具有抵抗力。值得注意的是，基于PMO的杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）療法Eteplirsen（圖7），已獲得FDA批準，成為基于 PMO的反義療法的里程碑事件。

圖6. DNA（單鏈）與PMO化學(xué)結(jié)構(gòu)比較，圖片來源：Front. Microbiol.

圖7. Eteplirsen化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖，圖片來源：Wikipedia

02

RNA干擾和治療性siRNA

• RNA干擾（RNAi，RNA interference）

        RNA干擾途徑是一種自然調(diào)節(jié)過程，通過小尺寸雙鏈RNA（dsRNA）下調(diào)基因表達。通常分為三個類型：

        小干擾 RNA (siRNA，small interfering RNA)

        微小 RNA (miRNA，microRNA) 

        Piwi 相互作用 RNA (piRNA)

        基于RNAi的療法，涉及將合成的小RNA雙鏈體（例如siRNA、人工miRNA和小發(fā)夾 RNA (shRNA)）遞送到確定的靶細胞中，產(chǎn)生基因沉默效果。

        這些小RNA分子連接并激活蛋白質(zhì)復(fù)合物，尤其是RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物 (RISC)。一旦結(jié)合，它們就可以與目標mRNA 結(jié)合，并在物理上阻止核糖體繼續(xù)合成相關(guān)蛋白質(zhì)，標記該mRNA以進行破壞。RNA干擾可以在mRNA自然降解之前將其破壞，終止致病路線。

        RNA干擾還可以在細胞合成機器制造病毒蛋白之前，攻擊細胞的mRNA，有時甚至攻擊基因組，從而保護細胞免受病毒侵害。

03

寡核苷酸藥物遞送

        同很多大分子藥物一樣，寡核苷酸療法面臨的一個重要挑戰(zhàn)在于藥物遞送，特別是基于RNA的藥物遞送，因為它們的細胞攝取通常效率差，而且在生理條件下的穩(wěn)定性低。

        使用脂質(zhì)制劑可以解決這一問題，或者制備含有識別分子的綴合物。例如Patisiran （Onpattro），針對遺傳性運甲狀腺素蛋白介導(dǎo)的淀粉樣變性引起的多發(fā)性神經(jīng)病。Patisiran是第一個被批準此適應(yīng)癥的siRNA藥物，通過利用脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 將藥物直接輸送到肝 臟。

        Givosiran（Givlaari）的獲批用于治療人肝卟啉癥，這是一個具有里程碑意義的事件，因為這是首次使用N-乙酰半乳糖胺三聚體（GalNAc，圖 8）主動轉(zhuǎn)運siRNA藥物至肝 臟，siRNA分子抑制氨基乙酰丙酸合酶。該制劑通過皮下注射，使siRNA在靶肝細胞中積累。它的成功催生了其他幾種siRNA的藥渡遞送路徑，例如Inclisiran （Leqvio），Lumasiran（Oxlumo），以及Vutrisiran或Amvuttra。

圖8. GalNAc三聚體化學(xué)結(jié)構(gòu)，來源：Chemistry Today

●展望●

        寡核苷酸代表的新療法正在大步向前，前進道路上的目標主要涉及尋找和開發(fā)新的靶點和作用機制。

        孕育新藥的領(lǐng)域之一，在于使用寡核苷酸作為microRNA的調(diào)節(jié)劑。miRNA的失調(diào)與許多人類疾病有關(guān)，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫性疾病。合成miRNA在調(diào)節(jié)內(nèi)源miRNA表達的領(lǐng)域中大有可為。miRNA療法可分為兩大策略：

        1）miRNA模擬物（激動劑，dsRNA）：用于恢復(fù)受抑制的miRNA水平；

        2）內(nèi)源性miRNA抑制劑（拮抗劑，ssRNA），稱為antimiRNA或antagomir，下調(diào)過度活躍的miRNA表達。

        在三聚體的GalNAc作為遞送物質(zhì)，成功將寡核苷酸藥物靶向肝細胞后，這個領(lǐng)域的研發(fā)熱情已經(jīng)被帶動起來，其中的一個熱點是制備用于肝外遞送的新型寡核苷酸偶聯(lián)物，尤其是多肽-寡核苷酸和脂質(zhì)-寡核苷酸綴合物的開發(fā)。由小分子和寡核苷酸組合形成的偶聯(lián)物新實體也很重要，這些小分子可以通過受體介導(dǎo)的機制促進藥物的細胞攝取，也可以通過protac（蛋白降解靶向嵌合體）降解途徑誘導(dǎo)蛋白水解。適配體（Aptamer）也代表著寡核苷酸藥物開發(fā)的一種重要方向。

        DNA納米技術(shù)將是另一個錦上添花的領(lǐng)域，它可以為治療和診斷提供精細的納米結(jié)構(gòu)，從而改善寡核苷酸藥物的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特性。

        最后，寡核苷酸行業(yè)將面臨一個重要挑戰(zhàn)，它來自CMC領(lǐng)域，即以更少的試劑和溶劑消耗生產(chǎn)寡核苷酸藥物。在更環(huán)保的條件下優(yōu)化生產(chǎn)，將是寡核苷酸工業(yè)界CMC未來幾年的主要方向。

        參考資料：

        1. Lee, J. Antisense PMO cocktails effectively skip dystrophin exons 45-55 in myotubes transdifferentiated from DMD patient fibroblasts. PLoS One. 2018; 13(5): e0197084.

        2. Extance, A. Oligonucleotide drugs step up. Chemistry World. 23. 09. 2015.

        3. Nan, Y. et al. Antisense Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers as Novel Antiviral Compounds. Front. Microbiol. 2018, 9. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00750

        4. Oligonucleotide Therapeutics. A Long And Windy Road Towards Future Medicines. 2023. 41. 12-15.