2023年4月24日，國家藥典委員會(huì)官網(wǎng)發(fā)布“關(guān)于通則0512高效液相色譜法修訂草案的公示”，擬對(duì)2020年版《中國藥典》第三部第456頁暨第四部第61頁收入的方法——0512高效液相色譜法部分內(nèi)容進(jìn)行修訂，公示期自發(fā)布之日起3個(gè)月。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，以下簡稱HPLC）是色譜法的一個(gè)重要領(lǐng)域之一，HPLC具有分析速度快、分離效能高、檢測靈敏度好等特點(diǎn)，已成為化學(xué)、醫(yī)藥工業(yè)等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。

       一、了解色譜法常用專業(yè)術(shù)語

       1.高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，以下簡稱HPLC）：

       是指采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對(duì)供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并進(jìn)入檢測器檢測，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號(hào)。

       2.色譜分析法（Chromatography）：

       簡稱色譜法或?qū)游龇?，是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法，該法利用某一特定的色譜系統(tǒng)（薄層色譜、高效液相色譜或氣相色譜等系統(tǒng)）進(jìn)行混合物中各組分的分離分析。

       3.固定相：

       在色譜分離中固定不動(dòng)，對(duì)樣品產(chǎn)生保留的一相。

       4.流動(dòng)相：

       帶動(dòng)樣品向前移動(dòng)的另一相。

       5.保留時(shí)間(retention time，tR)：

       定義為被分離組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)該組分最大響應(yīng)值時(shí)的時(shí)間，也即從進(jìn)樣到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點(diǎn)時(shí)為止所經(jīng)歷的時(shí)間，常以分鐘(min)為時(shí)間單位，用于反映被分離的組分在性質(zhì)上的差異。

       二、常見的HPLC色譜柱，你知道幾種？

       在藥品檢測領(lǐng)域，有“四大名譜”，它們分別為色譜、光譜、質(zhì)譜、波譜，可以說只要有分析任務(wù)的地方都在使用色譜分析法，《0512高效液相色譜法》收載的常用的HPLC色譜柱種類，分別是：

       1)反相色譜柱：以鍵合非極性基團(tuán)的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復(fù)合硅膠和聚合物等；常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基硅烷鍵合硅膠等。

       2)正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團(tuán)的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。

       3)離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。

       4)手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。

       三、新舊0512高效液相色譜法主要內(nèi)容搶先看

       根據(jù)2020年版《中國藥典》實(shí)施以來的反饋意見，結(jié)合各國藥典色譜法通則的修訂變化，此次有以下幾項(xiàng)內(nèi)容有發(fā)生變化，紅色字體為刪除內(nèi)容，藍(lán)色字體為增訂內(nèi)容變更主要內(nèi)容對(duì)照如下：

       1．進(jìn)一步完善色譜參數(shù)調(diào)整范圍。

       （4）色譜參數(shù)調(diào)整品種正文項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件（參數(shù)），除填充劑種類、流動(dòng)相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑與長度、填充劑粒徑、流動(dòng)相流速、流動(dòng)相組分比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器靈敏度等，均可適當(dāng)調(diào)整。

       若需使用小粒徑（約2μm）填充劑和小內(nèi)徑（約2.1mm）色譜柱或表面多孔填充劑以提高分離度或縮短分析時(shí)間，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配，必要時(shí)，色譜條件（參數(shù)）可適當(dāng)調(diào)整。

       色譜參數(shù)允許調(diào)整范圍見表。

表一色譜參數(shù)允許調(diào)整的范圍

       表 允許調(diào)整的色譜參數(shù)及范圍

       注：F1為調(diào)整前原規(guī)定流速；F2為調(diào)整后流速；dc1為調(diào)整前原規(guī)定色譜柱的內(nèi)徑；dc2為調(diào)整后色譜柱的內(nèi)徑；dp1為調(diào)整前原規(guī)定色譜柱的粒徑；dp2為調(diào)整后色譜柱的粒徑；Vinj1為調(diào)整前原規(guī)定進(jìn)樣體積；Vinj2為調(diào)整后進(jìn)樣體積；L1為調(diào)整前原規(guī)定色譜柱柱長；L2為調(diào)整后色譜柱柱長；tR為峰保留時(shí)間；Wh/2為峰半高峰寬。

       2．增加滯留體積對(duì)梯度分離影響的描述。

       可通過相關(guān)軟件計(jì)算表中流速、進(jìn)樣體積和梯度洗脫程序的調(diào)整范圍，并根據(jù)色譜峰分離情況進(jìn)行微調(diào)。

       調(diào)整后，系統(tǒng)適用性應(yīng)符合要求，且色譜峰出峰順序不變。通常，較小的填充劑粒徑需增加線速度，較大的填充劑粒徑需降低線速度，在按上表調(diào)整流速時(shí)，要注意儀器的壓力限值。若減小進(jìn)樣體積，應(yīng)保證檢測限和峰面積的重復(fù)性；若增加進(jìn)樣體積，應(yīng)使分離度和線性關(guān)系仍滿足要求。

       對(duì)于梯度洗脫，柱尺寸（柱長和柱內(nèi)徑）改變導(dǎo)致柱體積改變，會(huì)影響控制選擇性的梯度洗脫體積。可通過調(diào)整梯度洗脫體積使其與柱體積成比例。由于梯度洗脫體積是梯度時(shí)間（tG）和流速F的乘積，因此需要對(duì)每個(gè)梯度段的梯度時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，以保持梯度洗脫體積與柱體積的比值恒定（表示為L×dc2）。由原來的梯度時(shí)間（tG1）、流速、柱長和柱內(nèi)徑，按下式計(jì)算新的梯度時(shí)間（tG2）。

       tG2=tG1×(F1/F2)×[(L2×dc)/(L1×dc)]

       梯度洗脫條件的調(diào)整可分步進(jìn)行：（1）根據(jù)L/dp調(diào)整柱長和粒徑；（2）根據(jù)粒徑大小和柱內(nèi)徑的變化調(diào)整流速；（3）根據(jù)柱長、柱內(nèi)徑和流速的變化，調(diào)整每個(gè)梯度段的梯度時(shí)間。

       若減小進(jìn)樣體積，應(yīng)保證檢測限和峰面積的重復(fù)性；若增加進(jìn)樣體積，應(yīng)使分離度和線性關(guān)系仍滿足要求。應(yīng)評(píng)價(jià)色譜參數(shù)調(diào)整對(duì)分離和檢測的影響，必要時(shí)對(duì)調(diào)整色譜參數(shù)后的方法進(jìn)行確認(rèn)。若調(diào)整超出表中規(guī)定的范圍或品種項(xiàng)下規(guī)定的范圍，被認(rèn)為是對(duì)方法的修改，需要進(jìn)行充分的方法學(xué)驗(yàn)證。

       調(diào)整梯度洗脫色譜參數(shù)時(shí)應(yīng)比調(diào)整等度洗脫色譜參數(shù)時(shí)更加謹(jǐn)慎，因?yàn)榇苏{(diào)整可能會(huì)使某些峰位置變化，造成峰識(shí)別錯(cuò)誤，或者與其他峰重疊。如梯度微調(diào)后仍不能滿足系統(tǒng)適用性要求，通常應(yīng)考慮滯留體積的緣故或更換色譜柱。

       滯留體積（dwell volume，用D或VD表示)，也稱為梯度延遲體積，是指從流動(dòng)相混合點(diǎn)至柱入口之間的體積。梯度洗脫時(shí)，所采用設(shè)備的配置可顯著地影響方法所述的分離度、保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間。如果發(fā)生這種情況，可歸因于過大的滯留體積。因此，應(yīng)考慮方法開發(fā)時(shí)的系統(tǒng)與實(shí)際使用系統(tǒng)之間滯留體積的差異，在開始梯度程序前增加一個(gè)等度平衡階段，通過調(diào)整等度階段時(shí)間來調(diào)整梯度時(shí)間點(diǎn)，以與所使用的分析設(shè)備相適應(yīng)。如在品種項(xiàng)下給出了方法開發(fā)時(shí)所

       用的滯留體積，則原梯度表中所述的時(shí)間點(diǎn)（t，min）可用按下式計(jì)算的調(diào)整后時(shí)間點(diǎn)（tc，min）代替：

       t_c=t- 

       式中D為實(shí)際使用的分析設(shè)備的滯留體積（ml）；

       D₀為方法開發(fā)時(shí)分析設(shè)備的滯留體積（ml）；

       F為流速（ml/min）。

       如驗(yàn)證證明分析方法應(yīng)用時(shí)不需等度平衡，則可省略這一等度階段。

       應(yīng)評(píng)價(jià)色譜參數(shù)調(diào)整對(duì)分離和檢測效果的影響，必要時(shí)對(duì)調(diào)整色譜參數(shù)后的方法進(jìn)行確認(rèn)。多個(gè)參數(shù)的調(diào)整將對(duì)系統(tǒng)性能產(chǎn)生累積影響，需要作適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

       對(duì)于組分或基質(zhì)特別復(fù)雜的體系，如中藥分析方法，進(jìn)行其色譜參數(shù)調(diào)整時(shí)應(yīng)特別謹(jǐn)慎。

       若調(diào)整超出表中規(guī)定的范圍或品種項(xiàng)下規(guī)定的范圍，被認(rèn)為是對(duì)方法的修改，需要進(jìn)行充分的方法學(xué)驗(yàn)證。

       3．在第一節(jié)增加（5）溶液制備的描述。

       （5）溶液制備 為減少溶劑峰和色譜峰的畸變，制備供試品溶液和參比物質(zhì)溶液可用流動(dòng)相（或梯度起始比例流動(dòng)相組成）作為溶劑；為提高供試品中待測成分與參比物質(zhì)的保留時(shí)間和峰面積響應(yīng)的一致性，制備供試品溶液和參比物質(zhì)溶液的溶劑組成盡可能保持一致。如供試品和/或參比物質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解性不夠，可先用流動(dòng)相組成中具溶解能力的某一溶劑或其它適宜溶劑制備供試品溶液或/和參比物質(zhì)溶液貯備液，再用流動(dòng)相（或梯度起始比例流動(dòng)相組成）稀釋到測試的濃度。

       在測試序列中，應(yīng)取制備溶液的溶劑和/或稀釋劑進(jìn)樣以確認(rèn)其是否對(duì)待測物質(zhì)峰有干擾。

       對(duì)于含量測定，單點(diǎn)對(duì)照法定量用供試品溶液與對(duì)照品溶液濃度應(yīng)相同或相近，確保在分析方法線性范圍內(nèi)，并有足夠的精密度。

       對(duì)于限度檢測，如有關(guān)物質(zhì)檢測，除另有規(guī)定外，供試品溶液濃度應(yīng)保證能準(zhǔn)確檢測0.1%的雜質(zhì)，對(duì)照溶液或?qū)φ掌啡芤簼舛葢?yīng)與所關(guān)注的限度濃度相當(dāng)。

       4．對(duì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)進(jìn)行修訂和補(bǔ)充：

       a.明確分離度（Rs）應(yīng)以半高峰寬（Wh/2）的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。

       （2）分離度（Rs）......無論是定性鑒別分析還是定量測定，均要求待測物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對(duì)照色譜峰及其他雜質(zhì)色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)不小于1.5。分離度的計(jì)算公式為：

       式中tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時(shí)間；

       tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時(shí)間；

       W1、W2及Wh/2,1、Wh/2,2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬，見下圖。

       當(dāng)對(duì)測定結(jié)果有異議時(shí)，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（Rs）均應(yīng)以峰寬 （W）半高峰寬（Wh/2）的計(jì)算結(jié)果為準(zhǔn)。

       b.增加峰谷比（p/v）作為系統(tǒng)適用性的參數(shù)。

       （3）峰谷比若待測物質(zhì)峰與相鄰峰之間未達(dá)到基線分離，如在有關(guān)物質(zhì)檢測時(shí)，峰谷比（p/v）可作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)參數(shù)。下圖表示部分分離兩個(gè)色譜峰的示意圖，峰谷比值計(jì)算公式為：

       式中Hp為小峰平行外推基線的高度

       H為小峰和大峰間曲線最低點(diǎn)平行外推基線的高度。

       峰谷比值計(jì)算示意圖

       c.定義靈敏度，修訂信噪比（S/N）計(jì)算公式。

       （4）靈敏度用于評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比 （S/N）來表示。建立方法時(shí)，可通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y定信噪比。定量測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于10；定性測定時(shí)，信噪比應(yīng)不小于3。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中可以設(shè)置靈敏度實(shí)驗(yàn)溶液來評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)的檢測能力。

       信噪比（S/N）用于定義系統(tǒng)的靈敏度，按下式計(jì)算：

       S/N=

       在使用規(guī)定的參比溶液獲得的色譜圖中， H為從目標(biāo)峰最大值到基線信號(hào)的峰高，基線外延距離為目標(biāo)峰半高峰寬的5倍；h距離為在目標(biāo)峰5倍寬范圍內(nèi)觀察到的最大和最小噪聲的幅度，見下圖。如可能，應(yīng)平均分布在目標(biāo)峰的兩側(cè)。

       通常，定量限的信噪比應(yīng)不小于10，檢測限的信噪比應(yīng)不小于3。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中可以設(shè)置靈敏度試驗(yàn)溶液來評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)檢測低含量成分的能力。

       d.重新對(duì)拖尾因子（T）作出規(guī)定。

       （4）（5）拖尾因子（T）

       除另有規(guī)定外，在檢查和含量測定項(xiàng)下，以峰面積作定量參數(shù)時(shí)，T值應(yīng)在0.8～1.8之間；以峰高作定量參數(shù)時(shí)，除另有規(guī)定外，T值應(yīng)在0.95～1.05之間。

       以峰面積作定量參數(shù)時(shí)，一般的峰拖尾或前伸不會(huì)影響峰面積積分，但嚴(yán)重拖尾會(huì)影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準(zhǔn)確性，此時(shí)應(yīng)在品種正文項(xiàng)下對(duì)拖尾因子作出予以規(guī)定。

       e.修訂對(duì)重復(fù)性的要求。

       （6）重復(fù)性 用于評(píng)價(jià)色譜系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)樣時(shí)響應(yīng)值的重復(fù)性能。除另 有規(guī)定外， 通常取各品種項(xiàng)下的對(duì)照品溶液或其它溶液，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣 5 次， 其 峰面積響應(yīng)測量值（或內(nèi)標(biāo)比值或其校正因子）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 2.0% ， 如品種項(xiàng)下規(guī)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差大于 2.0% ，則以重復(fù)進(jìn)樣 6 次的數(shù)據(jù)計(jì)算。視進(jìn) 樣溶液的濃度和/或體積、色譜峰響應(yīng)和分析方法所能達(dá)到的精度水平等， 以滿足 檢測所需的精密度要求為前提， 對(duì)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求可適當(dāng)放寬或收緊，放寬 或收緊的范圍以滿足品種項(xiàng)下檢測需要的精密度要求為準(zhǔn)并在品種項(xiàng)下予以規(guī)定。

       f.增加保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間作為評(píng)價(jià)系統(tǒng)適用性參數(shù)的描述。

       （7）其他參數(shù)保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間常用于評(píng)價(jià)系統(tǒng)適用性，如在品種項(xiàng)下列出但未明確為系統(tǒng)適用性要求，它們僅作為一種參考。實(shí)驗(yàn)得到的相對(duì)保留時(shí)間與品種項(xiàng)下規(guī)定值間的差異應(yīng)為多少，沒有適用的可接受標(biāo)準(zhǔn)。

       g.對(duì)于復(fù)雜體系，提出可在品種項(xiàng)下附對(duì)照?qǐng)D譜來評(píng)價(jià)系統(tǒng)適用性。

       對(duì)于復(fù)雜體系，可在品種項(xiàng)下附對(duì)照?qǐng)D譜，通過供試品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的比對(duì)來評(píng)價(jià)系統(tǒng)適用性。

       上述系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及其可接受標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)方法驗(yàn)證特別是耐用性試驗(yàn)結(jié)果在品種項(xiàng)下描述。如上述的與品種項(xiàng)下描述的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及其可接受標(biāo)準(zhǔn)不同，則以品種項(xiàng)下描述為準(zhǔn)。

       除品種項(xiàng)下描述的任何其他系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及其標(biāo)準(zhǔn)外，不論品種項(xiàng)下描述與否，用于檢查或定量分析時(shí)，重復(fù)性試驗(yàn)應(yīng)滿足本通則或品種項(xiàng)下的要求。在整個(gè)分析過程中，色譜系統(tǒng)應(yīng)滿足系統(tǒng)適用性要求，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果不被接受。

       5．在測定法中增加校準(zhǔn)曲線測定法。

       （6）校準(zhǔn)曲線法

       對(duì)于復(fù)雜藥物體系中的成分和/或待測成分量在較大范圍變化的含量測定，可采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。標(biāo)準(zhǔn)曲線法可分為外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。

       ①外標(biāo)校準(zhǔn)曲線法：精密稱取對(duì)照品（或工作對(duì)照品）適量，或精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，配制成不同濃度的系列溶液，精密量取系列溶液各適量，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量峰響應(yīng)，用峰響應(yīng)對(duì)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過最小二乘法計(jì)算出回歸曲線方程。在相同的色譜條件下，再精密量取供試品溶液適量，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量供試品溶液中待測成分的峰響應(yīng)，由待測成分的峰響應(yīng)和回歸曲線方程確定供試品溶液中待測成分的量。

       ②內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)曲線法：精密稱取對(duì)照品（或工作對(duì)照品）適量，或精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，與精密量取的內(nèi)標(biāo)溶液混合，配成含等量內(nèi)標(biāo)物的不同濃度待測成分的系列溶液，精密量取系列溶液各適量，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量待測成分和內(nèi)標(biāo)物的峰響應(yīng)比值，用峰響應(yīng)比值對(duì)待測成分濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過最小二乘法計(jì)算出回歸曲線方程。在相同的色譜條件下，再精密量取加有與對(duì)照品系列溶液相同量內(nèi)標(biāo)物的供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量供試品溶液中待測成分和內(nèi)標(biāo)物的色譜峰響應(yīng)比值，由待測成分的峰響應(yīng)比值和回歸曲線方程確定供試品溶液中待測成分的量。

       如適用，也可使用其他方法如標(biāo)準(zhǔn)加入法、內(nèi)插法等，并在品種正文項(xiàng)下注明。

       參考文獻(xiàn)

       [1]www.chp.org.cn