生物體按照蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，即氨基酸序列，將蛋白質(zhì)折疊和組裝到更高級(jí)別的空間構(gòu)象組織（二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)）。基于相同的原理，短肽也能夠采取空間二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如α螺旋和β折疊。

       這些構(gòu)象通常是由弱的非共價(jià)相互作用驅(qū)動(dòng)的，例如靜電相互作用、氫鍵、疏水作用或范德華力。此外，雙親短肽由于肽單體之間的分子間弱相互作用而易于自組裝。化學(xué)的進(jìn)步為分子設(shè)計(jì)提供了一種程序設(shè)計(jì)和控制的環(huán)境：本文將重點(diǎn)論述細(xì)胞穿透肽（Cell Penetrating Peptides, CPPs）分子設(shè)計(jì)方面的最新進(jìn)展。

       細(xì)胞穿透肽的應(yīng)用及化學(xué)結(jié)構(gòu)特征

       細(xì)胞穿透肽是一類(lèi)長(zhǎng)約5~30個(gè)氨基酸的短肽，能夠攜帶多肽，核酸，小分子藥物及病毒顆粒穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。人們用其作為載體，將運(yùn)載物轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞。過(guò)去的研究證明，用細(xì)胞穿透肽攜帶蛋白質(zhì)和多肽治療癌癥和炎癥性疾病的小鼠模型是有效的?；趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，人們認(rèn)為細(xì)胞穿透肽攜帶DNA或SiRNA治療疾病將成為可能。

       細(xì)胞穿透肽還可以提高病毒轉(zhuǎn)染的效率。因此，對(duì)于這種即可幫助治療疾病，又有可能助紂為虐，加速病毒傳播的雙刃劍，人們更需要加大研究力度以趨利避害。另外，細(xì)胞穿透肽可以攜帶熒光或放 射性試劑用于成像應(yīng)用?？傊?strong>細(xì)胞穿透肽攜帶治療基因或者藥物分子進(jìn)入細(xì)胞將有非常廣闊的臨床應(yīng)用前景。

       細(xì)胞穿透肽數(shù)據(jù)庫(kù)于 2012 年建立，由印度 Indraprastha Institue of Information Technology創(chuàng)建，現(xiàn)已更新至2.0 版，對(duì)于細(xì)胞穿透肽的分子設(shè)計(jì)具有很強(qiáng)的指導(dǎo)作用。細(xì)胞穿透肽數(shù)據(jù)庫(kù)顯示了 1699 個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞穿透肽序列，大多數(shù)是直鏈多肽（94.5%）。攜帶分子方面主要用于熒光團(tuán)的傳遞 (54%) ，與生物醫(yī)學(xué)相關(guān)的主要貨物分子是核酸（15%）。其余的貨物分子主要包括蛋白質(zhì) (9%)、生物素（8%）、納米粒子 (7%) 和肽藥物(4%) 。細(xì)胞穿透肽的研究主體集中在全L-氨基酸 (84.3%) 構(gòu)成的合成多肽(54.8%) 。此外，全D-氨基酸組成的細(xì)胞穿透肽的內(nèi)化效率和穩(wěn)定性，以及由 L- 和 D-氨基酸混合組成的細(xì)胞穿透肽，也有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。（圖 1）

       圖1. 細(xì)胞穿透肽數(shù)據(jù)圖

       常規(guī)的細(xì)胞穿透肽的分子設(shè)計(jì)都繞不開(kāi)以下三個(gè)關(guān)鍵參數(shù)：胍基含量（或者陽(yáng)離子氨基酸含量）、疏水性和雙親性。富含精氨酸（精氨酸側(cè)鏈為胍基，pKa約為12，在生理pH條件下為質(zhì)子化的胍基陽(yáng)離子）的細(xì)胞穿透肽，在一級(jí)結(jié)構(gòu)-功效領(lǐng)域經(jīng)受了深入的研究。

       在研究細(xì)胞穿透肽的氨基酸序列以及單個(gè)氨基酸殘基（例如正電荷）貢獻(xiàn)方面，膜模型，膜提取物以及體內(nèi)研究起到非常關(guān)鍵的角色，這些研究都對(duì)細(xì)胞穿透肽的分子設(shè)計(jì)起到了指導(dǎo)作用。盡管存在這些理論指導(dǎo)，單從多肽序列預(yù)測(cè)它的膜穿透性仍然非常困難。

       除了序列之外。多種化學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)，例如電荷、手性、芳香性和疏水性，及其相互作用通常是細(xì)胞穿透肽內(nèi)化的重要驅(qū)動(dòng)力。可以說(shuō)，多肽序列是基礎(chǔ)，在這個(gè)基礎(chǔ)之上的分子間的相互作用，決定了細(xì)胞穿透肽的功效。要設(shè)計(jì)出高效的細(xì)胞穿透肽，包括電荷、胍基、手性、疏水性和芳香性在內(nèi)的眾多參數(shù)，它們之間的相互作用，需進(jìn)一步的深入研究。

       基于以上考慮，細(xì)胞穿透肽的構(gòu)效關(guān)系和雙親多肽的空間構(gòu)象得到了充分的研究。電荷與雙親性是細(xì)胞穿透肽分子設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮的兩個(gè)主要因素。細(xì)胞穿透肽的內(nèi)化效果會(huì)因雙親性和多陽(yáng)離子的整體特性而發(fā)生變化。除此之外，多肽序列長(zhǎng)度與空間構(gòu)象對(duì)于多肽內(nèi)化有著與多陽(yáng)離子性同等重要的地位。

       富集陽(yáng)離子對(duì)細(xì)胞穿透肽的意義

       富含側(cè)鏈陽(yáng)離子氨基酸的肽序列在細(xì)胞穿透肽領(lǐng)域可謂至關(guān)重要。Tat肽（圖2） 的發(fā)現(xiàn)，是細(xì)胞穿透肽領(lǐng)域具有里程碑意義的事件。Tat (反式激活轉(zhuǎn)錄激活劑, Transactivating transcriptional activator) 肽是人類(lèi)免疫缺陷病毒 (HIV-1)的原始轉(zhuǎn)錄激活因子中殘基 48 至 60 的肽片段。Tat 改性的基因傳遞系統(tǒng)顯示出增強(qiáng)的跨多個(gè)生物膜（例如細(xì)胞膜、內(nèi)體膜和核膜）的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

       圖2. Tat肽化學(xué)結(jié)構(gòu)

       Tat肽包含六個(gè)精氨酸和兩個(gè)賴(lài)氨酸殘基，它們都屬于堿性氨基酸，側(cè)鏈分別為胍基和氨基，在生理pH條件下都因質(zhì)子化帶有正電荷。鑒于Tat的重大指導(dǎo)意義，最簡(jiǎn)單的細(xì)胞穿透肽模擬物設(shè)計(jì)為寡聚精氨酸也就不足為奇了。

       細(xì)胞穿透肽的內(nèi)化效果與陽(yáng)離子殘基之間的相關(guān)性已經(jīng)得到了證實(shí)。受到Tat (GRKKRRQRRRPQ) 和滲透素(RQIKIWFQNRRMKWKK) 的啟發(fā)，細(xì)胞穿透肽的分子設(shè)計(jì)主要集中在小的陽(yáng)離子肽（攜帶5個(gè)左右的正電荷），例如聚精氨酸和聚賴(lài)氨酸肽。研究最深入的細(xì)胞穿透肽模型，是基于寡精氨酸的R8 和 R9 （8個(gè)或9個(gè)連續(xù)精氨酸殘基的多肽，圖3）。

       聚陽(yáng)離子細(xì)胞穿透肽的吸收效率取決于序列長(zhǎng)度以及精氨酸殘基在多肽序列的位置。據(jù)報(bào)道環(huán)化可最大限度地增加精氨酸與細(xì)胞膜之間的作用，從而實(shí)現(xiàn)更高的吸收效率。除了精氨酸側(cè)鏈的胍基之外，多肽所帶的正電荷也可以通過(guò)其他氨基酸側(cè)鏈引入，例如賴(lài)氨酸（側(cè)鏈氨基）和組氨酸（側(cè)鏈咪唑基）。然而，聚精氨酸的內(nèi)化表現(xiàn)優(yōu)于聚賴(lài)氨酸和聚組氨酸 。因此，就內(nèi)化和引入機(jī)制而言，聚精氨酸也是研究最深入細(xì)胞穿透多肽。線(xiàn)性聚精氨酸的內(nèi)化效率取決于序列長(zhǎng)度以及精氨酸殘基的數(shù)量和位置。胍基團(tuán)具有與膜之間形成雙齒氫鍵的能力膜，因此其多肽內(nèi)化應(yīng)該與膜易位相關(guān)（圖4）。

       圖3. R8/9多肽化學(xué)結(jié)構(gòu)

       圖4. 精氨酸與賴(lài)氨酸同細(xì)胞膜表面磷脂基團(tuán)形成的雙齒和單齒氫鍵示意圖。

       疏水性和芳香性結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞穿透肽的意義

       除了陽(yáng)離子部分，親脂性部分對(duì)細(xì)胞吸收也很重要。對(duì)此，研究者提出了一種機(jī)制，認(rèn)為富含胍基的細(xì)胞穿透肽，其主鏈附近形成了疏水性的反（陰）離子，對(duì)于細(xì)胞穿透肽的內(nèi)化起到作用。反離子效應(yīng)首先表現(xiàn)為精氨酸殘基與膜組分之間的氫鍵相互作用，形成能夠穿過(guò)膜的復(fù)合物 。與此形成對(duì)比的是，富含賴(lài)氨酸的多肽中沒(méi)有觀察到這種強(qiáng)烈的反離子結(jié)合，這一發(fā)現(xiàn)反向證明了胍基反離子對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞穿透肽內(nèi)化的相關(guān)性。細(xì)胞穿透肽這種與疏水性反離子結(jié)合的特性稱(chēng)為這些肽的自激活特性。因此在關(guān)注多肽攜帶正電荷的同時(shí)，不可忽略細(xì)胞穿透肽疏水性研究，以及單一脂肪和芳香官能團(tuán)的貢獻(xiàn)。

       疏水性可以通過(guò)添加脂肪族或芳香族結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)。一些細(xì)胞穿透肽模擬物的研究證實(shí)，芳香族活化性?xún)?yōu)于脂肪族。 脂化是通過(guò)將不同長(zhǎng)度的烴鏈（烷基）連接到已知細(xì)胞穿透肽的N端 或其它合適的官能團(tuán)上。這種烷基化改性通過(guò)增強(qiáng)與膜的疏水相互作用提高細(xì)胞穿透肽的內(nèi)化效果。除了整合脂肪鏈外，多肽分子疏水性的提高也可以通過(guò)引入疏水性氨基酸（例如亮氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸）來(lái)實(shí)現(xiàn)。有報(bào)道稱(chēng)，在使用更疏水的丁基替換甲基之后，一個(gè)細(xì)胞穿透肽的活性提升了三倍。8 與之相應(yīng)的是，在同一項(xiàng)研究中，當(dāng) γ-dimethylsilaproline取代脯氨酸Pro構(gòu)建一個(gè)具有聚脯氨酸PPII螺旋結(jié)構(gòu)的細(xì)胞穿透肽 （圖5），其內(nèi)化效率得到了提高。這個(gè)結(jié)果可能歸結(jié)于多肽整體疏水性增加。

       圖5. 脯氨酸與γ-dimethylsilaproline化學(xué)結(jié)構(gòu)

       最近報(bào)道了一個(gè)具有細(xì)胞穿透特性的疏水性病毒肽gH 625（序列：HGLASTLTRWAHYNALIRAF，圖6）。 這種細(xì)胞穿透肽的設(shè)計(jì)來(lái)源于單純皰疹病毒I 型，用于運(yùn)載脂質(zhì)體 、量子點(diǎn) 、樹(shù)枝狀大分子 、無(wú)序蛋白質(zhì) 和 SPIONS (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles, 超順磁性氧化鐵納米粒子)。其化學(xué)結(jié)構(gòu)的雙親性也得到明顯體現(xiàn)。

       圖6. Gh 625疏水性細(xì)胞穿透肽結(jié)構(gòu)（紅色部分為疏水性氨基酸殘基）

       多肽疏水性也可以通過(guò)芳香族氨基酸殘基（色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）的引入得以增強(qiáng)。根據(jù) Wimley 和 White 的說(shuō)法，芳香族殘基在多肽插入細(xì)胞膜雙層界面的過(guò)程中具有優(yōu)勢(shì)的自由能。芘、暈苯和富勒烯被證明可以激發(fā)胍基陽(yáng)離子的活化，從而使富含精氨酸的細(xì)胞穿透肽穿越細(xì)胞膜。

       研究者又通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在保持多肽疏水性相同的前提下，芳香族官能團(tuán)是否比脂肪族官能團(tuán)提供更好的內(nèi)化效率。這些研究發(fā)現(xiàn)，相較于脂肪鏈來(lái)說(shuō)，芳香官能團(tuán)更有助于細(xì)胞穿透肽的內(nèi)化。因?yàn)榉枷阕宥嚯目梢酝さ鞍咨系姆枷惆被岙a(chǎn)生π-π 作用，它們可能有助于促進(jìn)或穩(wěn)定 多肽與膜的相互作用并幫助內(nèi)化。8這個(gè)概念被擴(kuò)展至各種 π作用（π-π、π-陽(yáng)離子、π-陰離子 和 π-偶極）對(duì)于多肽分子內(nèi)化的影響。

       陽(yáng)離子與疏水結(jié)構(gòu)的綜合考慮

       在細(xì)胞滲透肽的分子設(shè)計(jì)中，陽(yáng)離子與疏水性特征需要綜合考慮。滲透素多肽（penetratin）就是這樣的例子（圖7）。滲透素是從一個(gè)果蠅同源域蛋白中得到的。滲透素與質(zhì)膜的非極性部分的非靜電相互作用對(duì)于內(nèi)化很重要（這也解釋了雙親分子設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)，滲透中包含亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等非極性氨基酸殘基）。陽(yáng)離子殘基的數(shù)量、它們?cè)谝患?jí)結(jié)構(gòu)上的間距，在二級(jí)結(jié)構(gòu)上的相對(duì)位置，以及包含非肽元素（例如疏水性脂質(zhì)部分）的整合，對(duì)于細(xì)胞穿透肽的分子設(shè)計(jì)非常關(guān)鍵。

       圖7. 滲透素化學(xué)結(jié)構(gòu)（藍(lán)色為帶陽(yáng)離子的氨基酸殘基，紅色部分為疏水結(jié)構(gòu)）

       另一個(gè)例子是 Pep-1，它包括5個(gè)色氨酸（疏水性氨基酸，以增強(qiáng)多肽與細(xì)胞膜的疏水性作用）和帶正電荷的富含賴(lài)氨酸的片段 (KKKRKV,來(lái)自于病毒SV-40 T-抗原上的核定位序列nuclear localization sequence), 以及一個(gè)脯氨酸間隔，以增加多肽的柔性。

       同樣，MPG肽 (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV) 的設(shè)計(jì)理念是包含相同的親水性核定位序列，并將該序列與HIV-gp-41病毒片段的一個(gè)疏水序列偶合所得。把陽(yáng)離子氨基酸殘基、疏水性片段，以及雙親結(jié)構(gòu)以不同的方式整合在同一多肽分子中，就可以構(gòu)造和衍生出更多高效的細(xì)胞穿透肽。

       半胱氨酸細(xì)胞穿透肽

       面對(duì)細(xì)胞穿透肽功能實(shí)現(xiàn)過(guò)程中的種種挑戰(zhàn)，諸如內(nèi)化效率，內(nèi)體逃逸效率、循環(huán)時(shí)間，以及特異性和選擇性方面（對(duì)于細(xì)胞、組織、疾?。┑膯?wèn)題，細(xì)胞穿透肽設(shè)計(jì)已取得了相應(yīng)的進(jìn)展。其中的一個(gè)例子是富含半胱氨酸 (Cys) 的細(xì)胞穿透肽。

       該分子設(shè)計(jì)的靈感來(lái)自于在蛇毒中發(fā)現(xiàn)的一種毒素克羅胺 （Crotamine，圖8），它包含兩個(gè)核定位域（crot（2-18）和crot（27-39））。通過(guò)檢查crot（27-39）(序列：KMDCRWRWKCCKK)，研究者利用氨基酸殘基的系統(tǒng)替換和/或省略，以及深入的構(gòu)效研究，設(shè)計(jì)出一種富含半胱氨酸的十肽 (CRWRWKCCKK) 分子（圖9）。這種潛在的細(xì)胞穿透肽具有增強(qiáng)的內(nèi)化效率。

       圖8. 克羅胺Crotamine蛋白結(jié)構(gòu)（圖片來(lái)源：PDB: 1H5O）

       圖9. 克羅胺Crotamine核定位片段Crot (27-39) (上圖) 與細(xì)胞穿透十肽（下圖）分子結(jié)構(gòu)對(duì)比（藍(lán)色為保留部分）。

       單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)細(xì)胞穿透肽

       細(xì)胞穿透肽已成為細(xì)胞內(nèi)治療劑的熱門(mén)研究領(lǐng)域。因?yàn)橹辨溂?xì)胞穿透肽的天然限制，諸如內(nèi)體包埋、毒 性、細(xì)胞特異性差、穩(wěn)定性差和降解性強(qiáng)，以及不完 美的細(xì)胞滲透， 改性的細(xì)胞穿透環(huán)肽應(yīng)運(yùn)而生。相對(duì)于其直鏈前體，細(xì)胞穿透環(huán)肽具有增強(qiáng)的細(xì)胞穿透能力和改善的物化性質(zhì)，以及抵抗水解降解的穩(wěn)定性。一些細(xì)胞穿透環(huán)肽可以表現(xiàn)出不依賴(lài)內(nèi)體的攝取的特質(zhì)， 已報(bào)道了一些細(xì)胞穿透環(huán)肽具有核瞄準(zhǔn)特性。

       圖10展示了一些具有精氨酸和其它氨基酸 殘基的單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞穿透環(huán)肽。

       圖10. 包含精氨酸與色氨酸殘基的單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)細(xì)胞穿透環(huán)肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

       [WR]4 和 [WR]5兩個(gè)細(xì)胞穿透環(huán)肽結(jié)構(gòu)單元的特征表現(xiàn)在交替正電荷（精氨酸）與疏水性氨基酸（色氨酸）在序列中的出現(xiàn)。含有色氨酸和精氨酸殘基的單環(huán)細(xì)胞穿透環(huán)肽也可與潛在的治療藥物偶聯(lián)。例如，單環(huán)肽與多柔比星、紫杉醇和喜樹(shù)堿偶合， 其中多柔比星-環(huán)肽的加合物展示了內(nèi)化作用的效果。

       除此之外，幾種含有半胱氨酸和精氨酸殘基的單環(huán)肽，也顯著增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)不可滲透的磷酸肽（F')-Gly-(pTyr)-Glu-Glu-Ile (F'-GpYEEI)的吸收。含有色氨酸和組氨酸的環(huán)十肽有效增加了細(xì)胞不可滲透的磷酸肽與抗 HIV 藥物恩曲他濱（emtricitabine）的細(xì)胞內(nèi)傳遞。 [WR]4-[WR]4-[WR]4 三環(huán)肽含有交替的精氨酸與色氨酸殘基，它提高了 F'-GpYEEI 和熒光標(biāo)記的抗 HIV 藥物 (拉米夫定 (3TC)、恩曲他濱 (FTC) 和 siRNA) 的乳腺癌細(xì)胞系 MDA-MB-231的細(xì)胞攝取。

       在以上的細(xì)胞穿透環(huán)肽中，色氨酸和精氨酸殘基的連續(xù)排列組合，衍生出了具有不同細(xì)胞傳遞特性的不同類(lèi)型細(xì)胞穿透環(huán)肽。這些數(shù)據(jù)揭示了單環(huán)、雙環(huán)和三環(huán)細(xì)胞穿透肽的分子運(yùn)輸潛力，并為設(shè)計(jì)下一代藥物遞送肽提供了良好的基礎(chǔ)。

       總結(jié)

       需要注意的是，本文在討論細(xì)胞穿透肽的分子設(shè)計(jì)時(shí)，只介紹了多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)，也就是氨基酸序列方面的影響。由于篇幅原因，暫時(shí)沒(méi)有介紹二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)胞穿透肽的活性。

       盡管目前文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)胞穿透肽的分子設(shè)計(jì)非常詳盡，但將其轉(zhuǎn)化為臨床環(huán)境仍然是一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。細(xì)胞穿透肽的應(yīng)用領(lǐng)域廣闊且在不斷發(fā)展，更深入的機(jī)理探索導(dǎo)致了分子設(shè)計(jì)復(fù)雜性的增加。這其中包括開(kāi)發(fā)穩(wěn)定并且多域的環(huán)狀或自組裝納米結(jié)構(gòu)。此外，選擇性、靶向性、高效率等方面也需要進(jìn)一步發(fā)展。許多研究人員提出了通過(guò)可控的空間折疊、環(huán)化、二聚、訂合、自組裝，甚至不同主鏈的多肽模擬物的方式，以達(dá)到提高細(xì)胞穿透肽的穩(wěn)定性和活性的目的。

       然而，由于各種復(fù)雜內(nèi)化機(jī)理的研究發(fā)展，疾病的異質(zhì)性，以及可用于體外研究的細(xì)胞系種類(lèi)繁多，時(shí)至今日仍然沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)評(píng)估一種分子設(shè)計(jì)相對(duì)于另一種設(shè)計(jì)的內(nèi)化效率改進(jìn)。此外，龐大的異質(zhì)性貨物分子意味著，在評(píng)估細(xì)胞穿透肽的效率與活性的過(guò)程中，需要考慮更多的參數(shù)。在這方面，需要標(biāo)準(zhǔn)化的統(tǒng)一以及更多深入對(duì)比研究，以度量不同類(lèi)型的細(xì)胞穿透肽的表現(xiàn)。雖然細(xì)胞穿透肽設(shè)計(jì)已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)步，但在這一領(lǐng)域無(wú)疑仍有很廣闊的發(fā)展空間。

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