研究表明，靶蛋白的非酶功能在多種細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，并與許多人類疾病密切相關(guān)。然而，傳統(tǒng)的小分子抑制劑通常直接靶向催化功能域，通過抑制靶蛋白的酶促功能來發(fā)揮作用，而不影響非酶功能。近年來出現(xiàn)的靶向蛋白水解嵌合體PROTAC技術(shù)具有同時(shí)調(diào)控靶蛋白的酶功能和非酶功能的優(yōu)勢(shì)，從而為改善小分子抑制劑的不足和探索新的治療方案提供了潛在的策略。本文總結(jié)了針對(duì)靶蛋白非酶功能的PROTAC的最新進(jìn)展，并對(duì)未來發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

       酶的功能及PROTAC介紹

       經(jīng)典的酶通常由酶結(jié)構(gòu)域和非酶結(jié)構(gòu)域組成。酶的功能域是指酶執(zhí)行其催化功能的具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域。具體來說，酶活性位點(diǎn)包含一個(gè)結(jié)合區(qū)和一個(gè)催化區(qū)，它們分別參與底物的結(jié)合和催化底物發(fā)生特定化學(xué)反應(yīng)。而非酶功能區(qū)主要通過蛋白−蛋白相互作用（PPI）來調(diào)節(jié)底物蛋白活性，它獨(dú)立于催化功能，介導(dǎo)底物與信號(hào)通路中不同蛋白成分之間的相互作用，如：變構(gòu)調(diào)控、支架蛋白功能等。

       大量研究表明，各種靶蛋白的非酶功能區(qū)域參與了細(xì)胞分裂、分化、RNA代謝、DNA修復(fù)和基因組穩(wěn)定性的調(diào)控。此外，這些非酶的功能與各種人類疾病密切相關(guān)，如癌癥、心血管病，并在調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和決定細(xì)胞命運(yùn)中起著關(guān)鍵作用。然而，傳統(tǒng)的小分子抑制劑通常直接靶向酶的催化功能域，并通過抑制靶蛋白的酶促功能來發(fā)揮治療效果。然而，這些抑制劑通常不能阻斷靶蛋白的非酶功能，并且面臨著選擇性低、特異性差、臨床療效有限和耐藥性等問題。

       靶向蛋白降解技術(shù)（TPD）被認(rèn)為是一種富有治療前景且極具吸引力的治療策略。PROTAC通常由三部分組成：靶蛋白配體，E3泛素連接酶配體，以及連接鏈。PROTAC可以招募E3泛素連接酶，通過泛素−蛋白酶體系統(tǒng)（ups）促進(jìn)靶蛋白的泛素化，進(jìn)而降解。

       與傳統(tǒng)的直接抑制靶蛋白的藥物開發(fā)策略不同，PROTAC通過調(diào)節(jié)宿主蛋白降解系統(tǒng)來發(fā)揮作用。此外，PROTAC可以誘導(dǎo)整個(gè)靶蛋白的降解，可以同時(shí)阻斷靶蛋白的酶功能和非酶功能（圖1）。因此，通過PROTAC策略阻斷靶蛋白的非酶功能可能是解決傳統(tǒng)小分子抑制劑所面臨的疾病治療問題的一種新的和富有治療前景的策略。

       圖1.靶向酶結(jié)構(gòu)的PROTAC技術(shù)

       阻斷表觀遺傳靶標(biāo)非酶功能的PROTAC

       1 靶向EZH2的PROTAC

       表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列在不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)的可遺傳修飾。表觀遺傳修飾的異常廣泛存在于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，是抗腫瘤藥物開發(fā)的研究熱點(diǎn)。

       PRC2是多組合組蛋白中的一員，是表觀遺傳癌癥治療的重要靶點(diǎn)，具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性。PRC2復(fù)合物由EZH2、EED、SUZ12、RbAp46/48四個(gè)主要成員組成。PRC2復(fù)合物的過度激活通過沉默腫瘤抑制基因而誘導(dǎo)惡性腫瘤，EZH2是PRC2的一個(gè)核心和多功能的催化亞基，在多種癌癥類型中過表達(dá)，如肺癌、膀胱癌和乳腺癌。EZH2通過甲基化組蛋白H3的27位賴氨酸來抑制腫瘤抑制基因的表達(dá)。

       近年來，通過直接或間接靶向EZH2的抑制劑的開發(fā)取得了重大進(jìn)展。越來越多的證據(jù)表明，EZH2的致癌功能并不完全依賴于其酶活性。除了催化H3K27me和介導(dǎo)與各種細(xì)胞過程相關(guān)的基因沉默外，EZH2還介導(dǎo)多種癌癥中基因的激活，這些基因與EZH2/PRC2的酶促功能無關(guān)。

       然而，目前所報(bào)道的EZH2抑制劑僅通過靶向其組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性來下調(diào)H3K27me3的水平。由于對(duì)EZH2致癌活性的抑制作用不足，EZH2抑制劑的臨床療效有限，且僅對(duì)某些癌癥有效。因此，迫切需要開發(fā)一種新的靶向EZH2的治療策略。

       靶向蛋白降解策略PROTAC為完全阻斷EZH2的致癌活性提供了新的機(jī)會(huì)。

       最近，四川大學(xué)yu課題組通過將EZH2選擇性抑制劑EPZ6438與CRBN配體沙利度胺通過連接鏈連接，設(shè)計(jì)合成了EZH2 PROTAC 1（圖2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1可以完全抑制EZH2的致癌活性。其中，化合物1對(duì)PRC2亞基表現(xiàn)出顯著的降解效率，72h降解完全。研究發(fā)現(xiàn)，化合物1直接與EZH2蛋白結(jié)合，而不是SUZ12、EED和RBAP48。因此，化合物1可以將E3泛素連接酶招募到PRC2復(fù)合物附近，導(dǎo)致EZH2的泛素化和降解。EZH2介導(dǎo)的間接相互作用誘導(dǎo)了蛋白酶體對(duì)其他PRC2亞基的降解，包括EED、SUZ12和RBAP48。然而，由于PRC2亞基的選擇性較差，化合物1可能具有潛在的毒 性或副作用。未來對(duì)化合物1的研究應(yīng)集中于如何提高蛋白降解的靶點(diǎn)選擇性。

       圖2.靶向EZH2 PROTAC 1結(jié)構(gòu)

       溫課題組將選擇性EZH2抑制劑EPZ6438和VHL配體通過連接鏈進(jìn)行連接，獲得了選擇性的EZH2降解劑YM281 (3)和YM181 (4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這兩個(gè)EZH2 PROTAC可以靶向淋巴瘤中整個(gè)EZH2，通過降解EZH2，進(jìn)而阻斷EZH2的非酶功能（圖3）。此外，EZH2 PROTAC顯著降低了H3K27me3的水平，并誘導(dǎo)了細(xì)胞周期阻滯和凋亡。與此同時(shí)，對(duì)抑制劑EPZ6438耐藥的淋巴瘤細(xì)胞系表現(xiàn)出完全的抑制作用，在體內(nèi)抗腫瘤模型中也表現(xiàn)出較好的抑制效果。

       圖3. 靶向EZH2 PROTAC YM281 (3)和YM181 (4)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

       由于EZH2-PRC2和EZH2-TAD-cMyc-coactivator這兩種EZH2復(fù)合物對(duì)EZH2介導(dǎo)的促癌功能都非常重要，造成了目前EZH2抑制劑在腫瘤治療中的局限性。cMyc是一種難以被小分子靶向的致癌因子，它與EZH2有直接的PPI作用，并且獨(dú)立于PRC2復(fù)合物。

       因此，研究人員使用PROTAC技術(shù)設(shè)計(jì)了降解劑MS177 (5)（圖4），它可以同時(shí)針對(duì)EZH2的酶功能和非酶功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物5降解了PRC2復(fù)合物成分（包括EZH2、SUZ12、EED），下調(diào)了H3K27me3的水平，抑制了依賴于PRC2的傳統(tǒng)酶促功能。此外，它還能有效降解cMyc，抑制EZH2的非酶促功能。

       圖4. MS177 和MS8815的化學(xué)結(jié)構(gòu)

       金堅(jiān)團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種EZH2選擇性降解劑MS8815 (7)，以探索其在三陰性乳腺癌（TNBC）細(xì)胞中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物7在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-453細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了EZH2的高效降解（DC50 = 140 nm）。此外，化合物7在多個(gè)TNBC細(xì)胞系中均具有良好的抗增殖活性。因此，化合物7的開發(fā)克服了傳統(tǒng)靶向催化位點(diǎn)抑制劑僅針對(duì)TNBC細(xì)胞中EZH2的催化功能域的局限性。

       2 靶向HDAC6的PROTAC

       組蛋白去乙?；?（HDAC6）是HDAC家族中的一個(gè)微管相關(guān)成員，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，參與調(diào)節(jié)錯(cuò)誤折疊蛋白的降解、細(xì)胞形態(tài)和遷移。HDAC6的異常調(diào)控與癌癥、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病等多種疾病密切相關(guān)。已知的HDAC6選擇性抑制劑通過結(jié)合HDAC6的C端催化結(jié)構(gòu)域來阻斷酶的功能。然而，由于HDAC6中存在多個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖5），如C端泛素結(jié)合域（UBD）、N端催化結(jié)構(gòu)域和鋅指泛素結(jié)合域（ZNF-UBP），目前有多達(dá)45個(gè)HDAC6抑制劑未能靶向這些功能域。因此，迫切需要新的針對(duì)HDAC6的研發(fā)策略。

       圖5. HDAC6 的結(jié)構(gòu)域

       目前已經(jīng)成功報(bào)道了多種靶向HDAC6的PROTAC（圖6）。其中，化合物9是基于VHL配體的PROTAC，化合物12-14是基于CRBN配體的PROTAC（化合物13和14是陰性對(duì)照）。這些PROTAC都表現(xiàn)出顯著HDAC6的降解效果和抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。這些降解劑通過誘導(dǎo)整個(gè)靶蛋白的降解，同時(shí)阻斷HDAC6的酶促功能和非酶促功能。

       圖6.靶向HDAC6 PROTAC化學(xué)結(jié)構(gòu)

       阻斷腫瘤代謝靶點(diǎn)非酶功能的PROTAC

       煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（NAMPT）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）生物合成的關(guān)鍵酶，其在腫瘤代謝和炎癥中起關(guān)鍵作用。除了在腫瘤細(xì)胞的增殖和分化中的功能外，NAMPT還由于其細(xì)胞因子樣作用而影響免疫微環(huán)境。

       NAMPT被稱為“雙側(cè)蛋白”，分為胞內(nèi)NAMPT（iNAMPT）和胞外NAMPT（eNAMPT）兩種類型。研究表明，NAMPT抑制劑僅阻斷其酶功能，而不通過eNAMPT調(diào)節(jié)非酶功能。僅僅抑制NAMPT的酶功能不足以完全抑制NAMPT的致癌功能。由于有限的抗腫瘤功效和劑量依賴性毒 性(例如血小板減少和胃腸道副作用)，兩種NAMPT抑制劑(FK866和CHS-828)的臨床試驗(yàn)停止。因此，迫切需要新的策略來干擾NAMPT的非酶功能。

       盛春泉課題組報(bào)道了第一個(gè)可以降解NAMPT并減少eNAMPT分泌的PROTAC 15（圖7）, 化合物15通過UPS途徑直接降解iNAMPT，從而減少eNAMPT的分泌，促進(jìn)抗腫瘤免疫，從而阻斷NAMPT的酶和非酶功能。在腫瘤小鼠模型中，化合物15也表現(xiàn)出較好的抑制效果。

       此外，化合物15能以較低的細(xì)胞毒 性和更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性激活免疫反應(yīng)。PROTAC 15的開發(fā)使我們更好地了解NAMPT的非酶功能在重建免疫抑制腫瘤微環(huán)境中的作用，從而促進(jìn)了NAMPT靶向腫瘤免疫治療方法的發(fā)展。

       圖7. 靶向NAMPT PROTAC 15的化學(xué)結(jié)構(gòu)

       阻斷激酶非酶功能的PROTAC

       1 靶向有絲分裂激酶AURORA-A的PROTAC

       有絲分裂激酶AURORA-A在有絲分裂過程中對(duì)各種蛋白質(zhì)的磷酸化起著重要作用，其催化活性對(duì)整個(gè)細(xì)胞周期而言至關(guān)重要， AURORA-A被認(rèn)為是抗癌藥物發(fā)現(xiàn)的重要靶點(diǎn)。然而由于低臨床應(yīng)答率，AURORA-A激酶抑制劑的開發(fā)一直停滯不前。研究表明，AURORA-A的非酶功能區(qū)可以與MYC家族的原癌基因蛋白結(jié)合，使得N-MYC和C-MYC不能被蛋白酶體降解。并且，AURORA-A激酶抑制劑不足以消除AURORA-A的致癌活性。

       為了探索AURORA-A激酶的非酶功能，Wolf課題組將AURORA-A臨床抑制劑alisertib17與CRBN的E3連接酶配體結(jié)合，開發(fā)了PROTAC JB170（圖8）。研究發(fā)現(xiàn)，JB170可誘導(dǎo)AURORA-A的快速、有效和高度特異性降解。AURORA-A的酶活性被認(rèn)為主要在細(xì)胞周期的G2/M期起作用，而其在S期的功能可能與其酶活性無關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)，化合物18可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的S期阻滯，但對(duì)G2/M期的細(xì)胞聚集沒有明顯的影響。此外，作者也通過實(shí)驗(yàn)證明了化合物18阻滯S期主要由DNA復(fù)制過程中AURORA-A的非酶功能引起。

       圖8. JB170的化學(xué)結(jié)構(gòu)

       2 靶向FAK的PROTAC

       FAK是介導(dǎo)生長(zhǎng)因子受體和整合素相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶。FAK主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N-末端FERM結(jié)構(gòu)域、中心激酶結(jié)構(gòu)域和C-末端局部粘附靶向(FAT)結(jié)構(gòu)域（圖9）。雖然傳統(tǒng)的FAK抑制劑只作用于蛋白激酶結(jié)構(gòu)域以阻斷酶功能，但FAK的非酶功能在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中也是關(guān)鍵的，并且不能被報(bào)道的FAK抑制劑阻斷。因此，同時(shí)抑制FAK的激酶依賴性酶功能和激酶非依賴性支架功能是抗腫瘤藥物開發(fā)的新的研究方向。

       圖9.FAK的生物結(jié)構(gòu)特征

       耶魯大學(xué)Crews課題組開發(fā)了一種靶向FAK PROTAC 19?；衔?9通過1，2，3-三唑的聚乙二醇(PEG)，將FAK抑制劑defactinib（20)和 VHL配體進(jìn)行連接而成。PROTAC 19在低納摩爾濃度下選擇性降解（DC50=3.0nM，Dmax=99%）。除影響其激酶依賴性信號(hào)活性外，F(xiàn)AK的降解還減弱其激酶依賴性信號(hào)。例如，由于FAK介導(dǎo)的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性主要由激酶非依賴性途徑控制，去除FAK顯著阻礙了TNBC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

       圖10. 化合物19的化學(xué)結(jié)構(gòu)

       清華大學(xué)饒燏課題組開發(fā)了FAK PROTAC FC-11（圖11），并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了FAK的非酶功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)C-11可以有效、快速和可逆地降解FAK。同時(shí)，F(xiàn)C-11能有效降解小鼠生殖系統(tǒng)中的FAK，并顯著下調(diào)磷酸化FAK蛋白水平。

       圖11.FC-11的化學(xué)結(jié)構(gòu)

       Law研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種高效、選擇性的FAK降解劑GSK215。研究人員將VHL配體和臨床FAK抑制劑VS-471通過剛性且短的連接鏈進(jìn)行連接而成?；衔颎SK215誘導(dǎo)小鼠肝 臟中FAK的持續(xù)降解和延長(zhǎng)的PK/PD效應(yīng)(18小時(shí)內(nèi)Dmax為85%，96小時(shí)給藥后FAK水平降低60%）。值得注意的是，研究人員通過構(gòu)效關(guān)系（SAR）和X射線晶體學(xué)分析表明，化合物GSK215具有較高的降解能力源于一種不尋常的短而剛性的連接鏈，并產(chǎn)生高度協(xié)同的三元復(fù)合物。

       圖12. FAK降解劑GSK215的化學(xué)結(jié)構(gòu)

       針對(duì)其他靶點(diǎn)非經(jīng)典功能的PROTAC

       1 靶向FKBP12的PROTAC

       肺動(dòng)脈高壓（PAH）是先天性心臟病最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是心血管疾病防治的主要問題。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鐵在多環(huán)芳烴的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是PAH中的關(guān)鍵蛋白之一，參與調(diào)節(jié)人體內(nèi)鐵代謝平衡的關(guān)鍵蛋白hepcidin的表達(dá)。

       FK506結(jié)合蛋白12(FKBP12)可結(jié)合BMP I型受體并隨后抑制hepcidin。FKBP12的這種非經(jīng)典功能類似于非酶功能，因?yàn)樗耘c催化劑無關(guān)的方式調(diào)節(jié)其與細(xì)胞信號(hào)途徑的不同組分的相互作用。目前報(bào)道的免疫抑制劑雷帕霉素和FK506阻斷FKBP12與BMP I型受體的結(jié)合，從而增加hepcidin。然而，在臨床使用中，F(xiàn)KBP12抑制劑表現(xiàn)出免疫抑制副作用。

       饒燏課題組報(bào)道了PROTAC RC32（圖13）。RC32是由雷帕霉素與泊馬度胺連接而成。在小鼠模型中，化合物RC32通過激活BMP信號(hào)，成功地實(shí)現(xiàn)了hepcidin基因表達(dá)的上調(diào)。與雷帕霉素（24) 或FK506 (25），化合物RC32無免疫抑制活性。這項(xiàng)工作證實(shí)了PROTAC介導(dǎo)的FKBP12非經(jīng)典功能降解治療低hepcidin相關(guān)疾病的可靠性。

       圖13. RC32 的化學(xué)結(jié)構(gòu)

       2 靶向USP7的PROTAC

       作為一種重要的抑癌因子，p53是癌癥中最頻繁突變的基因之一。P53在人類癌癥中突變率大于50%。研究發(fā)現(xiàn)，突變之后的p53不僅失去對(duì)細(xì)胞正常生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，而且抑制野生型p53蛋白的功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。因此，開發(fā)新的藥物來治療p53突變癌癥仍然是一個(gè)緊迫的問題。然而，p53的突變是相對(duì)隨機(jī)的，這使得開發(fā)直接針對(duì)p53突變體的靶向藥物非常困難。

       泛素特異性蛋白酶7 (USP7) 通過去泛素化和穩(wěn)定MDM2，在調(diào)節(jié)p53含量中起關(guān)鍵作用。最近，上海藥物所周兵課題組設(shè)計(jì)合成了第一代小分子降解劑U7D-1（圖14)，U7D-1可有效且選擇性地降解USP7（DC50=33 nM）?；衔颱7D-1表現(xiàn)出與USP7抑制劑相當(dāng)或更強(qiáng)的對(duì)p53野生型癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性，尤其是在p53突變癌細(xì)胞(Jeko-1細(xì)胞，IC)中也顯示出顯著的抗增殖活性，而USP7抑制劑27顯示弱活性。進(jìn)一步的作用機(jī)理研究表明，U7D-1可能通過調(diào)節(jié)USP7的非酶功能區(qū)（凋亡和E2F途徑）誘導(dǎo)USP7降解，從而發(fā)揮對(duì)p53突變癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。

       圖14. 靶向USP7 PROTAC U7D-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)

       小結(jié)

       近年來，靶蛋白的非酶功能日益受到關(guān)注。由于PROTAC可以同時(shí)阻斷靶蛋白的酶和非酶功能，且不長(zhǎng)時(shí)間占據(jù)酶結(jié)合口袋以誘導(dǎo)整個(gè)蛋白的降解的優(yōu)勢(shì)而備受矚目。

       目前的研究表明，PROTAC在研究靶蛋白的非酶功能方面顯示出良好的優(yōu)勢(shì)，并發(fā)揮了有效的治療作用。相比于小分子抑制劑，PROTAC具有更高的靶選擇性、更強(qiáng)的療效、更低的耐藥風(fēng)險(xiǎn)和延長(zhǎng)的作用。

       因此，PROTAC介導(dǎo)的藥物靶標(biāo)的酶和非酶功能的抑制可導(dǎo)致藥物活性的顯著提高，提供了新的治療策略，也為研究靶蛋白的非酶功能和相關(guān)疾病的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。盡管目前PROTAC對(duì)非酶功能的研究還處于起步階段，還需要更多的研究來發(fā)現(xiàn)更多的策略，以調(diào)節(jié)靶蛋白的非酶功能。但我們依然相信，利用PROTAC阻斷蛋白質(zhì)的非酶功能可能成為藥物開發(fā)的新方向，前景一片光明。

       參考文獻(xiàn)

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