導(dǎo)語(yǔ)

       目前，各種測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為了藥物研發(fā)過程中的得力工具。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq），簡(jiǎn)單從字面理解，就是一種在單細(xì)胞水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析的技術(shù)。目前，這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛地應(yīng)用，并在應(yīng)用中不斷地快速發(fā)展，成為我們研究細(xì)胞類別、疾病發(fā)生過程等問題的有力工具。

       PART. 01

       為什么要用scRNA-seq？

       傳統(tǒng)的批量測(cè)序（bulk RNA sequencing）有一個(gè)繞不過的難題：細(xì)胞的異質(zhì)性。

       眾所周知，對(duì)于多細(xì)胞生物來說，盡管由同一個(gè)受精卵發(fā)育而來，但不同細(xì)胞之間的基因表達(dá)必然是有差異的，這些差異導(dǎo)致了細(xì)胞的分化，使不同的細(xì)胞承擔(dān)不同的生理功能。粗糙地看，不同器官、組織的細(xì)胞組成不同，但使分析變得棘手的問題在于，即使是在形態(tài)上無法區(qū)分的細(xì)胞之間基因表達(dá)水平和對(duì)刺激的反應(yīng)方面也存在很大的異質(zhì)性，這種異質(zhì)性在組織生物學(xué)和疾病的發(fā)展中起著重要作用，例如病原體細(xì)胞或癌細(xì)胞之間的表達(dá)異質(zhì)性可能與人類疾病有關(guān)，在進(jìn)行藥物研發(fā)時(shí)，細(xì)胞的異質(zhì)性也往往造成靶點(diǎn)難尋、耐藥性等問題。

       圖1. 腫瘤異質(zhì)性(Nature 2013 Vol. 501 Issue 7467 Pages 338-345)

       在使用多細(xì)胞水平的分析時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)信息很容易被掩蓋在多個(gè)細(xì)胞的平均信息中。比如大家非常熟悉的Western blot。當(dāng)我們使用Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)的含量時(shí)，我們無法區(qū)分目標(biāo)蛋白是在10%的細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，還是在50%的細(xì)胞里中等表達(dá)，還是在所有細(xì)胞中弱表達(dá)。但如果使用流式細(xì)胞術(shù)，我們就可以清晰地區(qū)分上述情況。

       圖2. Western blot VS 流式細(xì)胞術(shù)(https://zhuanlan.zhihu.com/p/28844468)

       單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也是一樣的道理。當(dāng)使用bulk RNA-seq時(shí)，每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差異同樣會(huì)被多個(gè)細(xì)胞的平均信息所掩蓋，而如果在單細(xì)胞水平對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，我們就可以得到異質(zhì)性信息，進(jìn)而可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行更準(zhǔn)確地分群、發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞種類、研究隨機(jī)基因的表達(dá)，以及對(duì)細(xì)胞譜系路徑進(jìn)行探索。為藥物研發(fā)提供更準(zhǔn)確的信息，開辟新的路徑，實(shí)現(xiàn)真正的“對(duì)癥下藥”。

       圖3. 單細(xì)胞測(cè)量保存了大量基因組分析丟失的關(guān)鍵信息(Genome Research 2015 Vol. 25 Issue 10 Pages 1491-1498)

       自從2009年由湯富酬等人開發(fā)出第一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，到今天已經(jīng)有幾十種不同的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)被開發(fā)出來，它們各自有不同的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)，我們可以在了解不同技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)之后，選擇最適合自己的研究的技術(shù)。

       圖4. scRNA-seq發(fā)展史

       圖5. 部分常用的scRNA-seq(Chen, G., et al. (2019). "Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis." Frontiers in Genetics 10(317).)

       PART. 02

       單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)原理

       單細(xì)胞測(cè)序基本流程通常分為以下幾個(gè)部分：?jiǎn)渭?xì)胞分離、基因擴(kuò)增、構(gòu)建信息庫(kù)、高通量測(cè)序、數(shù)據(jù)分析。單細(xì)胞分離技術(shù)分類眾多，單細(xì)胞分離溶解后獲得pg級(jí)的核酸，通過擴(kuò)增至ng或μg級(jí)，然后用于后續(xù)的測(cè)序。目前常用單細(xì)胞分離方法有有限稀釋法、顯微操作（手工細(xì)胞采集）、激光捕獲顯微切割、熒光活化細(xì)胞分選、磁活化細(xì)胞分選、微流體技術(shù)等。

       圖6. 單細(xì)胞測(cè)序流程 (李勃,朵泓睿.單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析方法研究進(jìn)展[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2021,38(05):129-135+142.)

       目前單細(xì)胞RNA測(cè)序常用技術(shù)有Tang RNA-seq、Smart-seq、Smart-seq 2、CEL-seq、Quartz-seq、STRT-seq、Drop-seq等，而利用這些技術(shù)構(gòu)建的被大規(guī)模使用的測(cè)序平臺(tái)有10xGenomics平臺(tái)、Illumina®Bio-Rad® 平臺(tái)、BD Rhapsody™ 平臺(tái)、ICELL8 平臺(tái)和C1™ 單細(xì)胞全自動(dòng)制備系統(tǒng)等等。接下來以10xGenomics平臺(tái)為代表具體介紹單細(xì)胞RNA測(cè)序過程中基因擴(kuò)增與信息庫(kù)構(gòu)建的具體過程。

       10xGenomics

       10×Genomics平臺(tái)基于微滴的核酸條形碼分配系統(tǒng)，該系統(tǒng)提供了數(shù)以百萬(wàn)計(jì)級(jí)的攜帶唯一DNA條形碼的微滴，通過微流控技術(shù)，首先將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴（GEMs）中。凝膠珠溶解，細(xì)胞裂解釋放mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用于測(cè)序的帶條形碼和UMI信息的cDNA。液滴油層破碎，cDNA擴(kuò)增，制備cDNA文庫(kù)，然后使用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，即可獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)和免疫組庫(kù)數(shù)據(jù)。

       圖7. 10xGenomics平臺(tái)流程圖 (https://zhuanlan.zhihu.com/p/269461589)

       10xGenomics技術(shù)的核心是油滴包裹的凝膠珠（GEMs）。GEM（10X Genomics Gel in Emulsion）是一個(gè)由 mRNA、磁珠、乳液組成的液滴狀反應(yīng)系統(tǒng)，后續(xù)的細(xì)胞分選、反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)都是在這個(gè)液滴反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行。GEMs 的結(jié)構(gòu)確保了＞90% 的油滴內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物都可以順利用唯一的 barcode 分子標(biāo)記。Gel bead由凝膠珠和磁珠上的一段引物構(gòu)成。Gel bead上連接的引物序列包含四個(gè)部分：Illumina TruSeq Read 1測(cè)序引物、16 nt的條形碼（Barcode）、12 nt的UMI和30 nt的Poly(dT)反轉(zhuǎn)錄引物

       圖8. GEM示意圖（左），Gel bead示意圖（右）

       具體流程是先將樣本制備成單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞質(zhì)檢然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活性測(cè)定，最終使細(xì)胞活性高于90%，細(xì)胞濃度為700～1200個(gè)細(xì)胞/μL。

       取75μL Master Mix＋細(xì)胞懸浮液、40μL的含有barcode信息的凝膠珠和280μL的油滴分別加入到Chromium Chip B的不同小室，經(jīng)由微流體“雙十字”交叉系統(tǒng)形成油滴包裹的凝膠珠（Gel Bead-In- EMulsions，GEMs）。有效的GEMs包含凝膠珠、單細(xì)胞、Master Mix和油。

       收集GEMs，并將其全部混合，凝膠珠在每個(gè)油滴內(nèi)自動(dòng)溶解釋放大量Barcode引物序列，細(xì)胞裂解釋放mRNA，mRNA與逆轉(zhuǎn)錄酶、凝膠珠上的poly dT反轉(zhuǎn)錄引物以及dNTP底物相接觸，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，產(chǎn)生用于測(cè)序的帶有Barcode和UMI信息的cDNA一鏈，再以SMART擴(kuò)增方法完成第二鏈合成。

       cNDA片段化油滴破碎，磁珠純化cDNA一鏈，然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

       cDNA擴(kuò)增完成后，首先利用化學(xué)方法將cDNA打斷成200- 300bp左右的片段，通過末端修復(fù)、加A進(jìn)行cDNA片段篩選，P7 adaptor接頭連接Read2測(cè)序引物，并通過PCR擴(kuò)引入樣品Index，最后進(jìn)行片段篩選，從而構(gòu)建含有P5和P7接頭的cDNA文庫(kù)。

       文庫(kù)完成以后，進(jìn)行庫(kù)檢，cDNA文庫(kù)庫(kù)檢合格后，直接在Illumina的測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成之后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

       數(shù)據(jù)分析

       單細(xì)胞RNA測(cè)序得到的數(shù)據(jù)通常從這幾個(gè)方面展開進(jìn)行：1、序列比對(duì)和表達(dá)水平量化；2、數(shù)據(jù)預(yù)處理；3、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化；4、高變異基因的選擇和降維分析；5、聚類分析；6、細(xì)胞類型注釋；7、差異表達(dá)的鑒定及富集分析；8、進(jìn)階分析：如細(xì)胞譜系追蹤、生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、空間轉(zhuǎn)錄組等。

       圖9. scRNA-seq的數(shù)據(jù)分析(李勃,朵泓睿.單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析方法研究進(jìn)展[J].重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2021,38(05):129-135+142.)

       PART. 03

       單細(xì)胞測(cè)序的優(yōu)缺點(diǎn)與

       現(xiàn)在一些主流技術(shù)之對(duì)比

       單細(xì)胞測(cè)序的第一個(gè)缺陷是樣本制備和建庫(kù)成本更高，數(shù)據(jù)量更大，更加復(fù)雜，需要更多時(shí)間、設(shè)備、容量來進(jìn)行該項(xiàng)工作。

       單細(xì)胞測(cè)序第二個(gè)缺陷是跨細(xì)胞的生物學(xué)誤差，是因?yàn)闃悠芳?xì)胞之間存在一些生物學(xué)變異，主要包括：

       1、轉(zhuǎn)錄脈沖，它指的是并不是所有基因的基因轉(zhuǎn)錄都處于啟動(dòng)階段，主要由捕獲時(shí)間來確定這些基因是打開還是關(guān)閉狀態(tài)；

       2、然后是每條RNA加工速度都不相同；

       3、環(huán)境刺激也會(huì)影響基因的表達(dá)；

       4、時(shí)序改變，指的是像細(xì)胞周期這樣的細(xì)胞時(shí)序變化過程，會(huì)影響單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)譜。

       單細(xì)胞測(cè)序的第三個(gè)缺陷是樣品之間的技術(shù)差異，主要包括：

       1、細(xì)胞特異性捕獲效率不同，不同細(xì)胞捕獲轉(zhuǎn)錄本不同，導(dǎo)致測(cè)序深度不同；

       2、文庫(kù)質(zhì)量：獲得的樣品中會(huì)存在降解的RNA、低存活力細(xì)胞、大量自由漂浮的RNA以及細(xì)胞定量不準(zhǔn)確，這些導(dǎo)致質(zhì)量指標(biāo)降低；

       3、擴(kuò)增偏差：在文庫(kù)制備的擴(kuò)增步驟中，并非所有轉(zhuǎn)錄本都擴(kuò)增到相同水平；

       4、批次效應(yīng)：可以從圖中看到因?yàn)榕尾煌斐杉?xì)胞表達(dá)顯著性差異，這就要求在實(shí)驗(yàn)中最好在同一天、同一個(gè)人在同一個(gè)地點(diǎn)完成所有RNA分離及建庫(kù)工作來盡量避免批次效應(yīng)。

       當(dāng)前單細(xì)胞測(cè)序用到的兩種主流技術(shù)主要為10x Genomics和smart-seq，他們有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

       首先是smart-seq 的大致步驟：細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液、帶poly（A）尾的RNA逆轉(zhuǎn)錄、模版轉(zhuǎn)換、cDNA的擴(kuò)增、cDNA片段化、加入文庫(kù)PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序。

       它的優(yōu)點(diǎn)主要在于相對(duì)于截短的cDNAs，該技術(shù)所采用的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶更傾向于選擇全長(zhǎng)cDNAs作為其末端轉(zhuǎn)移酶活性的底物。因此它的測(cè)序深度大大增加，基本每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的所有外顯子都能被檢測(cè)到，這使它可以用于檢測(cè)可變剪接，還可以在轉(zhuǎn)錄本層面進(jìn)行全面的突變分析，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。

       此外它的優(yōu)點(diǎn)還包括：

       1、進(jìn)行技術(shù)改進(jìn)后，Smart-seq2利用現(xiàn)成的試劑能生產(chǎn)更高質(zhì)量的文庫(kù)，且成本也有所下降，為分析大量細(xì)胞提供了可能性。

       2、Smart-seq2的方案組分和原理是公開的，讓研究人員可以進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行改良，目前在這個(gè)方案基礎(chǔ)上涌現(xiàn)了許多單細(xì)胞測(cè)序的新成果。

       它的缺陷是：建庫(kù)過程依賴于孔板，這使得它們難以達(dá)到很高的通量，smart-seq是基于96孔板的，那么同批次只能測(cè)96個(gè)細(xì)胞。

       Microwell 通過縮小孔體積來增加細(xì)胞數(shù)量，但依然受到限制。

       它的另一個(gè)缺陷是因?yàn)橐锏脑O(shè)計(jì)，只能選擇性識(shí)別聚腺苷酸化的RNA，所以不能分析沒有poly（A）的RNA。

       接下來是10x Genomics，它是依賴于液滴的，大致步驟就是通過微流控技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞和一個(gè)捕獲RNA的微珠包裹在液滴中，微珠連接的捕獲mRNa上已經(jīng)預(yù)先包含UMI和細(xì)胞條形碼信息，讓每個(gè)液滴帶上獨(dú)特信息，在液滴中完成mRNA的富集后將微珠合并，完成測(cè)序。

       它的優(yōu)點(diǎn)在于：

       1、在該方法中，含有細(xì)胞的油滴占所有油滴比例大約5%，這樣能夠更好地保證了含細(xì)胞的液滴中只含有一個(gè)細(xì)胞。

       2、每個(gè)液滴中均含有獨(dú)特的細(xì)胞條形碼和UMI，能夠區(qū)分單細(xì)胞。

       3、而且它不受限于孔板，可以短時(shí)間內(nèi)同批次處理更多的細(xì)胞。

       它的缺陷在于：

       1、微珠對(duì)mRNA的捕獲效率有限，在獲得細(xì)胞數(shù)量的突破的同時(shí)，能夠測(cè)得的細(xì)胞基因數(shù)較少，就是測(cè)序深度比較低。

       2、而且該技術(shù)測(cè)序多為3‘端測(cè)序，測(cè)得的序列相同性很高，靈敏度和準(zhǔn)確度都不及全場(chǎng)測(cè)序。

       PART. 04

       結(jié)語(yǔ)

       scRNA-seq為異質(zhì)性問題的解決提供轉(zhuǎn)錄組水平的解決方法，自這項(xiàng)技術(shù)問世以來，它就在飛速發(fā)展的同時(shí)得到了廣泛的應(yīng)用，從基因表達(dá)到細(xì)胞分群，再到譜系分析，scRNA-seq將這些點(diǎn)連成線，為今天的藥物研發(fā)提供了更多的方向。scRNA-seq在今天大放異彩，在未來的表現(xiàn)也同樣令人期待。

       關(guān)于筆者

       尋藥真理團(tuán)

       他們是南京大學(xué)新藥研發(fā)策略課程的學(xué)生，本篇為該課程中杜軼翔、徐倩、徐思瓊、李飛4名同學(xué)共同完成。

       他們朝氣蓬勃、他們斗志昂揚(yáng)，他們腳踏實(shí)地學(xué)習(xí)新藥研發(fā)知識(shí)，他們堅(jiān)信吾愛吾師吾更愛真理。

       他們是新一代醫(yī)藥行業(yè)接班人，他們是新藥研發(fā)領(lǐng)域的未來之光！

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