2021年10月26日，國(guó)家藥典委員會(huì)官網(wǎng)發(fā)布《細(xì)胞類制品微生物檢查法》公示稿，公示期為三個(gè)月，彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)細(xì)胞類制品快速微生物替代方法領(lǐng)域的空白。

       PART

       0 1.

       細(xì)胞類制品微生物檢查方法創(chuàng)新的必要性

       近年來(lái)，細(xì)胞類制品（如明星產(chǎn)品-細(xì)胞治療產(chǎn)品）突飛猛進(jìn)的發(fā)展，因其在臨床研究中取得的顯著療效而成為學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共同關(guān)注的焦點(diǎn)，在腫瘤領(lǐng)域（白血病、淋巴瘤等）治療中展現(xiàn)出顯著的治療效果而成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

       但該類制品在質(zhì)量屬性和無(wú)菌生產(chǎn)工藝上存在諸多特殊性，其個(gè)體差異大、產(chǎn)量少、效期短、臨床需求緊迫，終產(chǎn)品需要快速放行；加上作為無(wú)菌產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中，因細(xì)胞本身無(wú)法過(guò)濾除菌，無(wú)菌生產(chǎn)工藝要求更高，對(duì)過(guò)程控制要求也更高，無(wú)菌檢查試驗(yàn)仍按現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》中的無(wú)菌試驗(yàn)方法對(duì)細(xì)菌、真菌檢查，這將不利于細(xì)胞類制品的研發(fā)和最終產(chǎn)品的無(wú)菌保證，中檢院、上海藥檢所等多名無(wú)菌檢測(cè)領(lǐng)域?qū)＜野l(fā)文呼吁國(guó)內(nèi)應(yīng)參考《歐洲藥典》“細(xì)胞產(chǎn)品的微生物控制”（Microbiological Examinationof Cell-based Preparations），盡快制訂中國(guó)特色的無(wú)菌檢查方法。

       PART

       0 2.

       2020年版《中國(guó)藥典》微生物檢查方法用于細(xì)胞類制品局限性

       現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》（2020年版）傳統(tǒng)的無(wú)菌檢查方法存在局限性，表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

       (1) 檢測(cè)試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng),效率低下，一個(gè)試驗(yàn)周期至少需14天,不利于企業(yè)及早采取糾正措施,無(wú)法保證在產(chǎn)品使用前完成放行檢查。根據(jù)《細(xì)胞治療產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》（20171222）當(dāng)細(xì)胞治療產(chǎn)品放行檢驗(yàn)受到時(shí)間限制時(shí)，可考慮加強(qiáng)工藝過(guò)程中的樣品質(zhì)量監(jiān)控，將過(guò)程控制與放行檢驗(yàn)相結(jié)合，通過(guò)過(guò)程控制簡(jiǎn)化放行檢驗(yàn)。

       (2) 一些微生物在指定試驗(yàn)條件下不易生長(zhǎng)，即現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》（2020年版）傳統(tǒng)的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件可能不適合一些微生物的生長(zhǎng)，據(jù)報(bào)道有超過(guò)30%無(wú)菌檢查失敗發(fā)生在第7-14天。

       (3) 細(xì)胞類制品樣品量少，使無(wú)菌檢查試驗(yàn)檢測(cè)污染物的能力受到限制，污染程度越輕，出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果的可能性越大。

       PART

       0 3.

       中國(guó)特色的快速無(wú)菌檢查法規(guī)重點(diǎn)內(nèi)容搶先看

       《細(xì)胞類制品微生物檢查法》為快速微生物檢查法，主要適用于效期短、批量小，采用現(xiàn)行無(wú)菌檢查法（通則1101）無(wú)法保證在產(chǎn)品使用前完成放行檢查的細(xì)胞類制品。

       采用本法進(jìn)行產(chǎn)品的微生物放行檢查，應(yīng)在充分考慮制品生產(chǎn)工藝、無(wú)菌保障水平、微生物污染風(fēng)險(xiǎn)、使用者獲益/風(fēng)險(xiǎn)等因素的基礎(chǔ)上，經(jīng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后有條件地施行?！都?xì)胞類制品微生物檢查法》法系采用基于商品化全自動(dòng)微生物培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)方法，通過(guò)儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的二氧化碳引起的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)反應(yīng)底物的顯色或熒光變化信號(hào)，或培養(yǎng)瓶頂空壓力變化信號(hào)，結(jié)合目視觀察，判定供試品中有無(wú)微生物生長(zhǎng)，重點(diǎn)內(nèi)容梳理如下：

       1、培養(yǎng)基適用性檢查

       此部分概括了商品化的儀器適配的培養(yǎng)基適用性檢查的確認(rèn)條件。至少應(yīng)有2種適宜培養(yǎng)基用于檢測(cè)真菌、需氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌，包括無(wú)菌性檢查和靈敏度檢查。

       1.1促生長(zhǎng)試驗(yàn)用微生物

       檢測(cè)真菌、需氧細(xì)菌和厭氧細(xì)菌的培養(yǎng)基應(yīng)分別接種不大于100CFU的試驗(yàn)菌，中國(guó)特色《細(xì)胞類制品微生物檢查法》沒有列舉培養(yǎng)基適用性檢查用微生物的種類，筆者摘錄了歐洲藥典，促生長(zhǎng)試驗(yàn)用微生物示例，供國(guó)內(nèi)研究者參考，示例如下圖：

       1.2培養(yǎng)溫度

       置于系統(tǒng)確認(rèn)的培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，除另有規(guī)定外，接種細(xì)菌的培養(yǎng)基應(yīng)在3天內(nèi)生長(zhǎng)良好，接種真菌的培養(yǎng)基應(yīng)在5天內(nèi)生長(zhǎng)良好，中國(guó)特色《細(xì)胞類制品微生物檢查法》沒有列舉合理溫度設(shè)定的參數(shù)，筆者摘錄了歐洲藥典，自動(dòng)化培養(yǎng)系統(tǒng)或自動(dòng)化和人工結(jié)合試驗(yàn)法的合理溫度設(shè)定示例，供國(guó)內(nèi)研究者參考，示例如下圖：

       2、方法適用性試驗(yàn)

       應(yīng)至少采用2個(gè)批次的供試品進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，每批供試品應(yīng)至少平行進(jìn)行3個(gè)重復(fù)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，方法適用性試驗(yàn)示例如下表：

       3、供試品的快速無(wú)菌檢查

       3.1取樣

       供試品應(yīng)能代表細(xì)胞產(chǎn)品的所有組分，并從成品中取樣。如成品取樣不適用，可采用替代取樣方案，如選取在處理細(xì)胞最后接觸的液體中取樣。采用本法進(jìn)行生產(chǎn)過(guò)程的中間質(zhì)控時(shí)，應(yīng)從相應(yīng)質(zhì)控點(diǎn)取樣。

       3.2供試品的最少檢驗(yàn)量

       對(duì)于單個(gè)容器且總體積（V）在1ml~1L的單一批次細(xì)胞制劑，供試品的最少檢驗(yàn)量不應(yīng)低于下表；中間產(chǎn)品有多個(gè)容器時(shí)，每個(gè)容器應(yīng)分別取樣進(jìn)行檢測(cè)。取樣后應(yīng)盡快將供試品接種至培養(yǎng)基，如供試品需存放，應(yīng)評(píng)估存放的潛在污染風(fēng)險(xiǎn)。

       3.3培養(yǎng)及觀察

       將供試品接種至培養(yǎng)基后盡快置于儀器中培養(yǎng)，禁止儲(chǔ)存。培養(yǎng)時(shí)間不少于7天，根據(jù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果及特殊相關(guān)微生物的情況，可延長(zhǎng)至14天。

       3.4結(jié)果判斷

       (1) 若儀器判定各供試品管均為陰性結(jié)果，且目視觀察未見渾濁，則供試品可判為符合規(guī)定。

       (2) 若儀器判定有供試品管為陽(yáng)性結(jié)果，且目視觀察發(fā)現(xiàn)渾濁，則供試品判為不符合規(guī)定。

       (3) 若儀器判定供試品管為陰性結(jié)果，但目視觀察發(fā)現(xiàn)渾濁，或儀器判斷為陽(yáng)性結(jié)果，但目視觀察未發(fā)現(xiàn)渾濁，出現(xiàn)以上兩種情況時(shí)，取該培養(yǎng)物不少于1ml轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中，將原始培養(yǎng)物和新接種的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不少于4天，觀察接種的同種培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁；或取培養(yǎng)液涂片,染色,鏡檢,判斷是否有菌。如目視觀察發(fā)現(xiàn)渾濁或涂片發(fā)現(xiàn)有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。

       上述任何一種情況下如判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無(wú)效，即生長(zhǎng)的微生物非供試品所含，可對(duì)供試品進(jìn)行重試，重試時(shí)，應(yīng)重新取同量供試品，依法檢查，結(jié)果判定同上。

       應(yīng)至少符合下列條件之一，判為試驗(yàn)無(wú)效:

       (1) 無(wú)菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無(wú)菌檢查法的要求。

       (2) 回顧無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。

       (3) 在陰性對(duì)照中觀察到微生物生長(zhǎng)。

       (4) 供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。

       專欄作者：滴水司南

       生物醫(yī)藥高級(jí)工程師、執(zhí)業(yè)藥師，自媒體時(shí)代的藥政法規(guī)搬運(yùn)工，堅(jiān)定終身學(xué)習(xí)的目標(biāo)，堅(jiān)持學(xué)用結(jié)合，努力做到知行合一。

       參考文獻(xiàn)

       [1] 中國(guó)藥典委員會(huì)官網(wǎng)、歐洲藥典、中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)雜志等

       [2] www.gcpunion.org