如何提高移植物和移植受者的長期存活率是移植學研究的主題，其中，對于免疫抑制劑的研究占據著重要的地位，而免疫抑制劑一面是其抗排斥反應療效，另一面則是其不良反應。免疫抑制劑能抑制與免疫反應相關細胞（主要是T細胞和B細胞）的增殖和功能，降低免疫應答。由于各種免疫抑制劑的作用機制不同且其不良反應的程度多與使用劑量有關，因此，針對移植排斥反應發(fā)生的不同靶點和關鍵步驟常采用多種免疫抑制劑聯(lián)合的方案，這樣既可協(xié)同增強免疫抑制效果，又可降低各種免疫抑制劑的劑量和不良反應的發(fā)生率。

       APC 為抗原提呈細胞；IL為白細胞介素；TCR為T細胞受體；JAK為Janus激酶；PI3K為磷脂酰肌醇-3-激酶；mTOR為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；CN為鈣調磷酸酶；MAP激酶為有絲分裂原活化蛋白激酶；IKK為核因子-κB激酶抑制劑；NFAT為活化T細胞核因子；AP-1為激活蛋白因子；CKD/cyclins 為周期蛋白依賴激酶；IMPDH為次黃嘌呤核苷酸脫氫酶。

       近十年來，Treg細胞療法在一系列與移植相關和非移植相關的適應癥上進行了臨床試驗。雖然這些試驗都集中在安全性上，但所有試驗的一個核心主題是GMP方案在細胞分離、操作、擴增、劑量、特異性和給藥后細胞跟蹤方面的異質性。目前Treg在標準化方面達成了一些共識，但現(xiàn)實是Treg細胞的新穎性要求進行大量的人體研究和專注于GMP條件的優(yōu)化和標準化。部分研究更多的想要制造更純的細胞，這種想法基于供體反應特異性TREG比多克隆TREG能更好的治療移植效應T細胞反應。在人類中闡明和利用這一機制是很重要的，因為產物純度和同種異體抗原特異性的程度可能會對治療效果和輸注細胞數量產生影響。腎 臟的一個關鍵優(yōu)勢是活體供者有更大的后勤保障范圍，這就提供了連續(xù)獲取新鮮供者抗原的途徑，從而提供了供者特異性的Treg細胞。

       01、Treg分類

       由于慢性同種異體移植功能障礙和免疫抑制的長期副作用尚未完全解決，移植耐受仍然是器官移植領域的圣杯。在這一點上，外周循環(huán)和移植物微環(huán)境中調節(jié)性T細胞(Treg細胞)的增加被認為是誘導移植物耐受的重要因素。

       人和鼠的多克隆Treg細胞被經典地分為胸腺Treg細胞(tTreg)、外周Treg細胞(pTreg)和誘導型Treg細胞(iTreg)三大類，一些學者通過tTreg細胞上Helios和Neuropilin-1(NRP-1)的高表達來區(qū)分tTreg細胞和pTreg細胞。然而，Helios/NRP-1本身不能對人類的tTregs和pTreg細胞進行分類。

       外周循環(huán)中Treg細胞的特征是CD4+，高水平的IL-2受體α鏈(CD25high)，低水平的CD127和細胞內表達叉頭盒P3轉錄因子(FOXP3+)。新的深層免疫表型技術的采用證實了這種表型比最初認為的更具異質性，這些數據因Treg細胞的種類、類型、分化狀態(tài)和微環(huán)境的不同而不同。進一步的區(qū)分是通過鑒定趨化因子受體。

       02、目前研究報道的Treg細胞的特別性質

       A:Treg細胞的可塑性

       Treg細胞在炎性微環(huán)境中采用Th17樣效應細胞表型和功能的可能性是一個關鍵的安全問題。這是因為Th17細胞在急性和慢性同種異體移植排斥反應患者中升高，因此可能導致這兩種情況的惡化。另一種與Treg-Th17相互作用有關的途徑是，兩者最初都起源于Naive CD4+細胞，但其隨后的分化途徑分別由微環(huán)境中不含IL-6的轉化生長因子-β(針對Treg)或與IL-6(針對Th17)的存在所決定。微環(huán)境將Treg細胞轉化為促進排斥反應的Th17細胞的潛力可能決定了輸注Treg細胞的時間點。理論上，Treg細胞治療可以是主動的(即在患者發(fā)生排斥反應之前)，也可以是反應性的(即給予診斷為急性或慢性排斥的患者)。然而，目前尚不清楚Treg細胞能否在已經被Teffs滲透的微環(huán)境中誘導耐受。

       B: 旁觀者壓制效應

       Treg細胞治療可能會出現(xiàn)一個潛在的問題，因為Treg細胞一旦被激活，就可以以一種非抗原特異性的方式執(zhí)行它們的抑制功能。這種被稱為“旁觀者抑制”的效應是在轉基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的，在轉基因小鼠模型中，抗原特異性的CD4+CD25+T細胞最初需要與TCR介導的互補表位接觸才能激活。然而，一旦激活，這些細胞也能夠抑制第三方抗原特異性的效應CD4+T細胞。這一效應在同種異體皮膚移植的小鼠體內模型中也得到了證實。如果這一現(xiàn)象確實在我們的患者中重復出現(xiàn)，可能會對調節(jié)抗原特異性排斥反應，同時保持對病原體和潛在腫瘤新表位的免疫力產生影響。

       03、TREG代表性試驗

       A. TRACT試驗

       試驗招募9人，細胞分離采用Clinimacs系統(tǒng)，3周擴增過程中采用抗CD3/CD28拮抗劑、IL-2、TGF-β、西羅莫司。最后得到純度>98% CD4+CD25+和>80% FOXP3+以及相似的去甲基化水平?；颊咴谝浦伯斕旌托g后第2天接受alemtuzumab治療，并維持使用MMF和他克莫司(第30天改用西羅莫司)。Treg細胞隨后在第60天被輸注。在報告的兩年中，沒有巨細胞病毒或多瘤病毒引起的機會性感染病例，也沒有發(fā)生排斥反應。這項試驗沒有報道在接受新腎移植的患者輸注多克隆Treg細胞后發(fā)生機會性感染或排斥反應的病例。

       B. TASK試驗

       相比之下，TASK試驗集中在利用多克隆Treg細胞來調節(jié)移植腎的亞臨床炎癥。這是一個重要的研究問題，因為亞臨床炎癥由于其慢性低級別的性質而沒有得到及時的診斷，并可能導致遲發(fā)性同種異體移植物功能障礙。

       患者接受體外擴增的自體Treg細胞，平均劑量為320*106個細胞。2周擴增：抗CD3/CD28拮抗劑，IL-2，重氫葡萄糖處理。最終得到純度>97%CD4+和>93% FOXP3+和<0.37% CD8+的產品。

       試驗招募了三名患者，他們在移植后6個月的活組織檢查中表現(xiàn)出這種炎癥(Banff i-和t-<2)。當患者獲得Treg細胞時，他們已經在服用MMF、他克莫司和強的松龍。重要的是，從安全性的角度來看，試驗報告說， Treg產品沒有直接導致SAE，在一年的隨訪期內也沒有報告感染或移植物功能障礙。然而，當前試驗的一個關鍵限制是，與另外一個試驗中超過12個月的檢測不到的情況相比，氘信號在3個月內無法檢測到。這就否定了這種技術的長期使用。在輸注后2周和6個月的腎活檢中，還沒有發(fā)現(xiàn)這些Treg細胞的報道。因此，目前還不清楚脫氫Treg細胞的產物是否能夠遷移到移植物中。補充這一事實的是，在輸注后2周，沒有患者在腎活檢組織中顯示FOXP3+%的表達增加，只有1例患者在6個月時出現(xiàn)這種情況。此外，盡管這項技術有助于短期追蹤，但它并不提供有關活體Treg功能的知識?？偠灾?，在腎移植中，在輸注FACS分離和多克隆擴增的德化Treg細胞后，沒有出現(xiàn)SAE。TASK試驗目前正在比較多克隆和同種異體抗原特異性Treg細胞的療效(NCT02711826)。

       C. ONE試驗（德國）

       ONE試驗是評估腎移植后通過輸注自體自然調節(jié)T細胞(nTreg)來重塑患者的免疫平衡是否安全、可行，并使終生大劑量免疫抑制(其療效有限、不良反應、高直接和間接成本)逐漸減少，同時在有用的概念驗證疾病模型中解決nTreg治療的幾個關鍵挑戰(zhàn)，例如簡單可靠的制造、過度免疫抑制的危險、與標準護理藥物的相互作用以及炎癥環(huán)境中的功能穩(wěn)定性。

       參與者：活體供腎移植受者(ONEnTreg13，n=11)和相應的參照組試驗(ONErgt11-CHA，n=9)。

       干預方式：CD4+CD25+FoxP3+nTreg產品在腎移植后7天靜脈注射0.5、1.0或2.5-3.0×106細胞/kg體重，隨后逐步減少三重免疫抑制至小劑量他克莫司單藥治療，直至48周。

       結果測量：主要臨床和安全終點在第60周由一個綜合終點進行評估，并進行進一步的三年隨訪。評估包括活檢證實的急性排斥反應的發(fā)生率，對注射nTreg相關不良反應的評估，以及過度免疫抑制的跡象。次要終點包括同種異體移植的功能、全面的探索性生物標志物組合等。

       對于所有患者來說，在腎移植前兩周采集40-50毫升的外周血液就可以生產出產量、純度和功能性都足夠高的nTreg產品。三個nTreg劑量遞增組均無劑量限制性**。nTreg組和參照組的同種異體移植物三年存活率為100%，臨床和安全性特征相似。在接受nTregs治療的11名患者中，有8名(73%)獲得了穩(wěn)定的單藥免疫抑制，而對照組仍在接受標準的二聯(lián)或三聯(lián)藥物免疫抑制(P=0.002)。

       在這個試驗中第一：沒有任何炎癥反應跡象。第二：沒有看到任何過度免疫抑制的臨床感染現(xiàn)象，這之前是假定的安全性問題。作者認為，在沒有T細胞受體或CD28刺激的情況下，Treg細胞在幾天內失去激活，甚至死亡。因此，只有經過反復抗原刺激的Treg克隆才能保持其抑制能力，并能在體內擴張。第三，作者觀察到輸注的Treg產物的多克隆T細胞受體在體內隨著時間的推移而轉變?yōu)楣芽寺∧Ｊ?，這表明了同種異體抗原驅動的選擇過程。同樣，在體外用同種異體抗原替代抗CD3/28的多克隆抗體，在幾天內就會產生一個偏向的T細胞受體譜系，這表明即使在注射多克隆nTregs之后，也有特異性的免疫調節(jié)作用。第四，注射nTreg僅導致Treg計數暫時增加。四周后循環(huán)Tregs減少的原因可能是nTregs集中于發(fā)炎的移植物或缺乏持久的植入物。最后，nTreg組表達了較少的常規(guī)T細胞激活，自然殺傷細胞成熟，這可能表明nTreg在體內的作用方式。需要強調的是這個試驗中有數據表明nTregs聯(lián)合小劑量他克莫司單一療法不能充分控制先前存在的致病記憶或效應免疫細胞。這一假說應該在后續(xù)研究中仔細研究。

       04、Treg療法總結

       目前有兩種主要的方法制造Treg細胞：在體內擴增Treg細胞和在GMP條件下體外擴增Treg細胞。大多數中心都專注于Treg的體外擴增，比較這兩種方法的數據對于確定臨床上利用Tregs的最佳方法至關重要。此外關于Treg異質性的討論將有助于臨床安全方案的開發(fā)。

       未來的另一個關鍵問題將是Treg細胞治療試驗中的免疫抑制管理。根據移植中心的方案，不同的患者目前接受不同的免疫抑制方案(例如：不使用類固醇，推遲鈣調神經磷酸酶抑制劑的引入)，劑量不同。在設計試驗時，考慮到這些免疫抑制劑是很重要的，因為同時免疫抑制可以調節(jié)Treg細胞的存活和功能。另一個未解決的問題是，Treg細胞的基因修飾是否可以增強它們對移植排斥反應的體內調節(jié)。關于Treg的異質性，盡管新技術可能有助于加深對Treg細胞及其亞群的理解，但將這些技術用于常規(guī)臨床用途是不切實際的，在經濟上也是不可行的。因此，關鍵問題是，我們需要深入到什么程度？我們可能只利用昂貴的新技術進行臨床前實驗，以確定和驗證Treg細胞以獲得最佳的體內活性。然后，可以對這些數據進行反向工程，使其適用于臨床可用的分析，以便于在更大規(guī)模的多中心試驗中使用。

       目前Treg療法盡管試驗數據有限，但在安全性和有效性已經初步顯示出了療效。隨著基礎科學研究的發(fā)展和進一步的臨床研究，相信Treg細胞在腎移植的應用潛力會逐步釋放。

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