新型冠狀病毒（COVID-19）肺炎疫情對世界人民造成了不可估量的影響。目前，針對COVID-19，已經(jīng)在臨床上應(yīng)用了瑞德西偉、羥氯喹等抗病毒 藥物，但世界各地的研究人員都仍在努力開發(fā)針對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的抑制劑。

       研究亮點(diǎn)

       近日，來自德國呂貝克大學(xué)生物化學(xué)研究所RolfHilgenfeld團(tuán)隊(duì)用X射線以1.75埃分辨率解析了新冠病毒Mpro的晶體結(jié)構(gòu)。新冠病毒中的主要蛋白酶（Mpro，又稱為3CLpro）能夠處理病毒中的多聚蛋白—病毒RNA在進(jìn)入人類細(xì)胞后最初被翻譯成這種多聚蛋白。蛋白酶從多聚蛋白中切割出12個更小的蛋白，而這些蛋白質(zhì)將會參與病毒RNA的復(fù)制。因此冠狀病毒的主要蛋白酶（Mpro，又稱為3CLpro）是一個重要的潛在藥物靶標(biāo)，對抑制病毒的復(fù)制至關(guān)重要。此外，該研究探討了一種α-酮酰胺抑制劑的抗SARA-CoV-2病毒作用。通過優(yōu)化結(jié)構(gòu)，研究人員將先導(dǎo)化合物開發(fā)成為SARS-CoV-2Mpro的有效抑制劑。優(yōu)化抑制劑的藥代動力學(xué)特征顯示出明顯的肺向性，并且適用于通過吸入途徑給藥。相關(guān)工作發(fā)表于Science上。

       圖1  參考文獻(xiàn)1截圖

       Idea的產(chǎn)生

       這項(xiàng)研究的idea是基于他們之前的一項(xiàng)研究基礎(chǔ) ( J. Med. Chem., 2019,https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01828)，他們之前已經(jīng)篩選出能夠明顯抑制MERS-CoV活性的先導(dǎo)化合物11r(EC50=0.4 nM)。因此，借東風(fēng)而來，期望更上一層樓。

       盡管11r抑制MERS-CoV的效果已經(jīng)很好了，但是，三個方面的不足促使去做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化：1、盡管基因高度相似，但病毒的種類已變化，一點(diǎn)微小的變化都會是成千上萬人付出生命的代價；

       2、由于分子內(nèi)邁克爾受體型酰胺鍵的影響，化合物11r的在血漿中易于被細(xì)胞蛋白酶裂解，半衰期降低，無法成藥；3、由于肉桂酰基結(jié)構(gòu)的疏水性和親電作用強(qiáng)，化合物11r在血漿中的溶解度較小并與人血漿蛋白結(jié)合率較高（大于90%）。為解決以上問題，該研究團(tuán)隊(duì)首先將酰胺鍵隱藏在吡啶酮環(huán)中（圖2，綠色圓圈部分），以期這可能會阻止細(xì)胞蛋白酶裂接近該鍵并使其裂解。此外，為了增加化合物在血漿中的水溶性和減少脫靶，他們用疏水性較小的叔丁基羰基（Boc基團(tuán)）取代了疏水性強(qiáng)的的肉桂?；糠种螅t色圓圈部分）得到了化合物13a。

圖2  化合物的初步設(shè)計 （圖片來源：參考文獻(xiàn)1）

       SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶的解析

       那么，在化合物基團(tuán)的改變后，是否仍然能夠同SARS-CoV-2病毒的主要蛋白酶（Mpro）結(jié)合? 于是文章首先解析了SARS-CoV-2 Mpro的晶體結(jié)構(gòu)（分辨率為1.75?）（圖3）。結(jié)果很明顯，SARS-CoV-2 Mpro的三維結(jié)構(gòu)與SARS-CoV Mpro的三維結(jié)構(gòu)高度相似，也驗(yàn)證了之前的猜測。相對于SARS-CoV Mpro, 在SARS-CoV-2 Mpro中觀察到Thr285Ala置換后兩個結(jié)構(gòu)域III彼此更靠近。此外，分析超速離心測定結(jié)果也表明兩種酶的二聚體解離的估計Kd相同（大約2.5 μM）。該結(jié)構(gòu)域的解碼為下一步抗冠狀病毒 藥物的設(shè)計奠定了基礎(chǔ)。

圖3  SARS-CoV-2 Mpro的晶體結(jié)構(gòu)（分辨率為1.75Å） （圖片來源：參考文獻(xiàn)1）

       抑制劑的設(shè)計思路及藥代動力學(xué)評價

       完成SARS-CoV-2 Mpro的晶體結(jié)構(gòu)的解析后，該團(tuán)隊(duì)使用該晶體結(jié)構(gòu)來對接α-酮酰胺13a。很遺憾的是文章沒有給對接圖，但文章給出的信息表明13a中吡啶酮環(huán)可能會擠壓189位的殘基Gln，但是他們在之前的研究就證明了這個位點(diǎn)的氨基酸特別柔性，對活性影響較小。另外，與11r相比，該化合物在小鼠中的血漿半衰期增加了約3倍，體外動力學(xué)血漿溶解度提高了約19倍，熱動力學(xué)溶解度約為13倍。與小鼠血漿蛋白的結(jié)合率從99％降至97％。以上對接及藥物代謝動力學(xué)的結(jié)果讓人感覺看到了一條康莊大道，但隨之而來的SARS-CoV-2的主要蛋白酶抑制活性研究結(jié)果給人潑了一盆冷水。然而，他們仔細(xì)分析了化合物13a失活的原因后，得出結(jié)論：13a中P2部分的環(huán)己基空間結(jié)構(gòu)大，會對蛋白酶中的S2部分?jǐn)D壓，而且在此前的研究中引入環(huán)己基結(jié)構(gòu)主要是為了廣譜的抗病毒活性。此外，不同種類病毒蛋白酶的S2部分對病毒的活性影響不一樣。接下來，該團(tuán)隊(duì)認(rèn)為“魚”和“熊掌”不可兼得，于是舍棄化合物的廣譜抗病毒活性，專一針對SARS-CoV-2的活性抑制進(jìn)行化合物的設(shè)計及優(yōu)化。因此，他們選擇用空間位阻較小的環(huán)丙基取代了環(huán)丙基，得到化合物13b(圖4)。在這里筆者不禁有點(diǎn)疑惑，為什么選擇了環(huán)丙基，而沒有選擇其他空間結(jié)構(gòu)較小的基團(tuán)，例如三氮唑或者更小的甲、乙及炔基等？可能他們也做了很多的篩選和嘗試，但文章只列了其最優(yōu)的結(jié)果。此外，P1,位置則由環(huán)丙基又換成了苯基，在這篇文章里，并沒有給出具體的解釋，但從他們之前的研究中，可以發(fā)現(xiàn)苯基相對于環(huán)丙基空間結(jié)構(gòu)更大，更容易卡在蛋白酶的活性位點(diǎn)，起到穩(wěn)定作用。

圖4  化合物的進(jìn)一步優(yōu)化 （圖片來源：參考文獻(xiàn)1）

       接下來便是化合物13b同蛋白酶共結(jié)晶結(jié)果分析，結(jié)果表明經(jīng)過一系列修飾后的化合物13b能夠很好地結(jié)合病毒的蛋白酶活性位點(diǎn)（圖5）。其中，通過催化Cys145對抑制劑的α酮基的親核攻擊，在可逆反應(yīng)中形成了硫代半縮醛。該硫代半縮醛的氧陰離子（或羥基）同His41形成穩(wěn)定的的氫鍵，而且酰胺上的氧則同Gly143，Cys145和部分Ser144的形成氫鍵。α-酮酰胺的優(yōu)勢在于它們可以通過兩個氫鍵相互作用與目標(biāo)蛋白酶的催化中心發(fā)生相互作用，而不是像其他結(jié)構(gòu)（例如醛）或邁克爾受體那樣只有一個作用位點(diǎn)。另外，P1位置的γ-內(nèi)酰胺部分則能深深地嵌入病毒主要蛋白酶的S1口袋中，而且內(nèi)酰胺上的氮能同殘基Phe140，Ser1和Glu166形成氫鍵，而羰基氧與His163形成氫鍵。P2處的環(huán)丙基甲基部分恰好嵌入S2亞位點(diǎn)，并且不會擠壓S2區(qū)域，從而克服了13a上環(huán)己基結(jié)構(gòu)的缺點(diǎn)。P3-P2位置上的吡啶酮占據(jù)了病毒主要蛋白酶的主要活性區(qū)域，其酰胺上的氧能同Glu166形成氫鍵，而氮則被封住，不能同Gln189形成氫鍵。P3上的Boc基團(tuán)則不占據(jù)蛋白酶的S4位點(diǎn)（與SARS-CoV Mpro復(fù)合的其他抑制劑的保護(hù)基團(tuán)相反），但位于Pro168附近，從而擠壓Pro168，使其向外移動超過2?（與游離酶的結(jié)構(gòu)相比）。這也解釋了為什么化合物14b去除Boc基團(tuán)后，抑制能力降低約2倍。有趣的是，化合物13b的吡啶酮環(huán)和殘基Thr190和Gln189之間還有較大的空間間隙，表明這個位置還可以接受比吡啶酮更大體積的基團(tuán)。這是不是也為接下來的研究者指明了下一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化的方向？當(dāng)然，我們也可以利用現(xiàn)在強(qiáng)大的虛擬數(shù)據(jù)庫設(shè)計出更加新穎的結(jié)構(gòu)。

圖5  化合物13b同SARS-CoV-2蛋白酶 (Mpro) 共結(jié)晶圖 （圖片來源：參考文獻(xiàn)1）

       接下來的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物13b能夠抑制純化的重組SARS-CoV-2 Mpro（IC50 = 0.67±0.18 μM）。在新型冠狀病毒SARS-CoV-2感染的人源Calu3細(xì)胞中，病毒的RNA復(fù)制也被明顯的抑制（EC50=4-5μM）。然而，缺少Boc基團(tuán)的化合物14b幾乎沒有活性（圖6），這又是為什么呢？究其原因可能是具有疏水性和大體積的Boc基團(tuán)的化合物13b容易滲透細(xì)胞膜，但是從前面的研究也可以看出并不是疏水性越強(qiáng)越好，疏水性太強(qiáng)會導(dǎo)致化合物同人血漿蛋白率結(jié)合過高。其實(shí)我們可以考慮用其他的基團(tuán)取代，例如直接叔丁基或者芐基等等。另一個問題是疏水性和親水性在藥物的設(shè)計中往往是非常重要的考慮因素，會影響藥物在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝及排泄，是不是又要開始摸頭發(fā)了。

圖6  13b和14b的結(jié)構(gòu)及其抗SARS-CoV-2病毒活性結(jié)果 （圖片來源：參考文獻(xiàn)1）

       最后，藥物代謝動力學(xué)研究結(jié)果表明化合物13b在小鼠和人微粒體的代謝穩(wěn)定性良好，在血漿中的平均停留時間延長至2.7 h，血漿半衰期明顯增加至1.8 h，與人血漿蛋白結(jié)合率降低至90%且在血漿中清除的速度較慢。更重要的是，對于肺部吸入給藥，小鼠未顯示任何不良反應(yīng)，這表明將化合物13b可直接施用于肺部。

       總結(jié)

       目前世界新冠肺炎疫情愈發(fā)嚴(yán)重，全球新冠確診人數(shù)接近150萬，死亡人數(shù)接近9萬[3]，而且還在急劇的攀升中。盡管以前也發(fā)生過SARS和MERS，但是世界暫時仍然沒有治療SAS-Cov-2的有效手段。然而，新冠病毒主要蛋白酶（Mpro，又稱為3CLpro）的晶體結(jié)構(gòu)解碼及新的抑制劑開發(fā)則為目前全球肆掠的SAS-Cov-2甚至未來可能的冠狀病毒 藥物研發(fā)提供了可能的策略和方向。此外，這篇文章的工作首先是值得肯定的，但是這也只是簡單的結(jié)構(gòu)優(yōu)化，有很多細(xì)節(jié)也還沒有考慮到，距離開發(fā)成能臨床應(yīng)用的抗新型冠狀病毒 藥物還為時尚早。冬天走了，春天還會遠(yuǎn)嗎？

       文獻(xiàn)來源

       [1] Zhang linlin etal., Crystal structure of SARS-CoV-2 main protease provides a basis for design ofimproved α-ketoamide inhibitors. Science. 2020, DOI:10.1126/science.abb3405

       [2] Zhanglinlin et al., α-Ketoamidesas broad-Spectrum inhibitors of coronavirus and enterovirus replication: structure-Baseddesign, Synthesis, and activity assessment. 2020, DOI:10.1021/acs.jmedchem.9b01828

       [3] WHO官網(wǎng)