冷泉港實(shí)驗(yàn)室的研究人員在研究一種乳腺癌細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)奇怪現(xiàn)象。之前的研究顯示這種癌細(xì)胞的增殖是由于一種 MELK 的蛋白過(guò)度表達(dá)引起的，但研究人員在使用 CRISPR 基因編輯技術(shù)敲除了編碼該蛋白的基因后，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)居然沒(méi)有受到任何影響。
更不可思議的是，之前認(rèn)為靶向 MELK 的藥物依然能很好地抑制 MELK 敲除的癌細(xì)胞生長(zhǎng)，哪怕藥物應(yīng)該針對(duì)的靶點(diǎn)已經(jīng)不存在了。
研究人員覺(jué)得應(yīng)該看看別的靶點(diǎn)是否也存在這個(gè)問(wèn)題。由此，他們開(kāi)展了一項(xiàng)系統(tǒng)研究，并在最近宣告解開(kāi)了一批癌癥藥物研發(fā)失敗的謎底：一種用來(lái)降低蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法的高脫靶率，在很大程度上影響了科學(xué)家對(duì)抗癌靶點(diǎn)的判斷。
這一研究發(fā)表了9月12日上線(xiàn)的《科學(xué)-轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)》（Science Translational Medicine）雜志。
01
什么是藥物靶點(diǎn)？
這里，需要先解釋一下靶點(diǎn)的概念。靶點(diǎn)是我們理解本研究的關(guān)鍵。
早期的癌癥藥物多數(shù)為細(xì)胞**藥物，尤其是影響細(xì)胞分裂的藥物。它們抗癌的原理是癌細(xì)胞通常具有比正常細(xì)胞更快的分裂速度，因此這些藥物對(duì)癌細(xì)胞的**更大。但這類(lèi)藥物對(duì)正常細(xì)胞**也很大，副作用非常明顯。
隨著研究的深入，人們逐漸理解到不同的癌癥是由不同的基因突變所導(dǎo)致，其不正常的生物學(xué)特性也是由于不同的細(xì)胞通路被異常激活或抑制。通過(guò)設(shè)計(jì)小分子藥物來(lái)特異性地影響這些通路中關(guān)鍵的蛋白（通常是酶），可以精準(zhǔn)地殺死或抑制癌細(xì)胞，把藥物對(duì)正常細(xì)胞的影響大大降低。這就是通常所說(shuō)的靶向藥物，它們所針對(duì)的關(guān)鍵蛋白被稱(chēng)為藥物靶點(diǎn)。
靶向藥物大大增加了人類(lèi)對(duì)抗癌癥的武器庫(kù)，《我不是藥神》電影中治療慢性髓細(xì)胞白血病的藥物原型格列衛(wèi)就是一種抑制酪氨酸激酶靶點(diǎn)的靶向藥。
好了，接下來(lái)可以進(jìn)入我們要介紹的論文了。
02
建在“不可靠”基礎(chǔ)上的藥物研發(fā)？
冷泉港的研究人員選取了10種不同的靶向藥物。這些藥物都在之前的研究中被認(rèn)為抑制了特定腫瘤靶點(diǎn)，而且都有報(bào)道這些靶點(diǎn)被抑制后足以阻礙癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
這10種藥物中，有7種已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，而另外3種也進(jìn)入臨床前開(kāi)發(fā)階段。這些藥物針對(duì)的靶點(diǎn)包括 CASP3，HDAC6， MAPK14，PAK4，PBK 以及 PIM1。
為了驗(yàn)證這些靶點(diǎn)確實(shí)影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)，研究人員在這些靶點(diǎn)起作用的細(xì)胞系中使用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)敲除了相應(yīng)靶點(diǎn)的基因。然而就像 MELK 一樣，所有這些靶點(diǎn)敲除了以后，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)都沒(méi)受到顯著的影響。
即使所有測(cè)試的靶點(diǎn)都恰好碰到不起作用的細(xì)胞系可能性很小，研究人員還是擴(kuò)大了測(cè)試范圍。例如，HDAC6 被報(bào)道對(duì)于 ARID1A 突變的卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)是必須的，研究人員在4種不同的 ARID1A 突變卵巢癌細(xì)胞（A2780，OVK18，OVTOKO，和TOV-21G）中敲除了 HDAC6，但卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有受到任何影響。
類(lèi)似地，PIM1 被報(bào)道在三陰乳腺癌中其重要作用，而研究人員在7種三陰乳腺癌細(xì)胞中敲除了 PIM1，都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著影響。而作為對(duì)照，已有成功藥物上市的靶點(diǎn)，如 MEK1，在A375黑色素瘤細(xì)胞系中敲除則顯著影響了細(xì)胞的生長(zhǎng)，證明了研究方法的可靠性。
這么多的癌癥靶點(diǎn)敲除后都沒(méi)有影響，研究人員意識(shí)到，篩選靶點(diǎn)的范圍可以擴(kuò)大。
接下來(lái)，他們?cè)?85種不同的癌細(xì)胞中進(jìn)行了 CRISPR 的全基因組范圍大規(guī)模篩選，結(jié)果和之前的數(shù)據(jù)吻合。一些已知的重要靶點(diǎn)，如 AuroraB，BRAF 和 PIK3A 等，總是可以在相應(yīng)的細(xì)胞系中被篩選到。而之前細(xì)胞系測(cè)試中不起作用的幾個(gè)靶點(diǎn)，在大規(guī)模篩選中也同樣不起作用。
很多靶點(diǎn)除了本身的抑癌功能，還能與別的抗癌藥物協(xié)同作用。例如，HDAC6 能夠?qū)ξ⒐艿鞍兹ヒ阴；?，抑制該酶使癌?xì)胞對(duì)靶向微管的藥物更加敏感。而目前有兩個(gè)臨床試驗(yàn)正在測(cè)試 HDAC6 抑制劑與紫杉醇（一種常用的抗癌藥，作用機(jī)制為干擾細(xì)胞分裂時(shí)微管的正常功能）聯(lián)合使用的效果。研究人員測(cè)試了 HDAC6敲除的癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn) HDAC6 的缺失并不能使細(xì)胞對(duì)紫杉醇以及其它4種抗癌藥物更敏感。作者測(cè)試了其它目前在臨床試驗(yàn)的靶點(diǎn)，如 MAPK14，得到的結(jié)果也類(lèi)似。這些實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，很多通過(guò)增強(qiáng)別的抗癌藥，從而 “曲線(xiàn)救國(guó)” 的可能性也被否定了。
這些結(jié)果無(wú)疑說(shuō)明，之前的很多抗癌靶點(diǎn)研究結(jié)論是不可靠的。而建立在不可靠基礎(chǔ)上的藥物開(kāi)發(fā)，失敗率居高不下也可以理解了。
03
RNAi實(shí)驗(yàn)是罪魁禍?zhǔn)祝?/strong>
如果說(shuō)某一項(xiàng)研究的結(jié)論不可靠，偶然因素可能性比較大。但是如果同類(lèi)型的研究不可靠性比例都很高，則可能是實(shí)驗(yàn)方法的系統(tǒng)性問(wèn)題。
研究人員仔細(xì)分析了這類(lèi)之前研究篩選有效，但敲除后相應(yīng)靶蛋白卻沒(méi)有影響的靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它們之前的結(jié)論都來(lái)自于RNAi實(shí)驗(yàn)。
RNAi 是一種用小分子 RNA 來(lái)降低蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法，相比基因敲除，這種方法實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單且成本較低，在 CRISPR 系統(tǒng)成熟之前，是大規(guī)?；蚪M篩選的主流方法。雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但這種方法有個(gè)很大的缺陷，即脫靶效應(yīng)比較嚴(yán)重。同一個(gè)小分子 RNA 在細(xì)胞里，可能同時(shí)抑制多種和其序列相似的基因表達(dá)。
為了驗(yàn)證 RNAi 是否有很高比例造成靶點(diǎn)誤讀，研究人員選取了一些之前研究中發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)，并使用相同的 RNAi 分子重復(fù)了前人的實(shí)驗(yàn)。
例如，以前的報(bào)告發(fā)現(xiàn)，PAK4 的 RNAi 分子在 HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞中抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，PIM1 在 MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞中抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，這些 RNA 分子確實(shí)能抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但是，經(jīng)過(guò)靶點(diǎn)的 CRISPR 敲除，研究人員發(fā)現(xiàn)，這些RNAi靶點(diǎn)敲除的細(xì)胞, 和沒(méi)有敲除的細(xì)胞一樣，生長(zhǎng)被相應(yīng) RNAi 分子所抑制。這確證無(wú)誤地表明，RNAi 實(shí)驗(yàn)的高脫靶率，在很大程度上影響了科學(xué)家對(duì)抗癌靶點(diǎn)的判斷。
最后，研究人員選取了一種目前正在臨床前研發(fā)階段的藥物 OTS964，做進(jìn)一步的研究。該藥物在針對(duì) PBK（TOPK）靶點(diǎn)的篩選中被發(fā)現(xiàn)。同樣，在使用 CRISPR 敲除 PBK 的癌細(xì)胞中，該藥物依然能很好地抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。這說(shuō)明這個(gè)化合物還有其它靶點(diǎn)。
通過(guò)高濃度 OTS964 誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生耐藥突變，研究人員使用全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn) OTS964 的真正靶點(diǎn)不是之前認(rèn)為的 PBK，而是一種細(xì)胞周期激酶 CDK11。同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)很多癌細(xì)胞的增殖都依賴(lài)于 CDK11,這也解釋了 OTS964 能夠在 PBK 敲除的癌細(xì)胞中對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生抑制。
研究的通訊作者 Jason Sheltzer 博士在冷泉港新聞發(fā)布會(huì)上表示： “很多抗癌藥物在人體試驗(yàn)時(shí)很不幸地不起作用。如果在這些藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)前，常規(guī)地獲取和我們的實(shí)驗(yàn)類(lèi)似的證據(jù)，我們可能能夠更好地將病人分配到最可能收益的試驗(yàn)中。有了這些知識(shí)，我相信我們能更好地踐行精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的承諾。”
04
時(shí)間會(huì)給出答案
但也有學(xué)者對(duì)這項(xiàng)研究提出了不同的意見(jiàn)。美國(guó)埃默里大學(xué)醫(yī)學(xué)院人類(lèi)遺傳學(xué)系教授金鵬認(rèn)為，作者過(guò)度解讀了他們的結(jié)果。 “ RNAi 實(shí)驗(yàn)可能是第一個(gè)用來(lái)發(fā)現(xiàn)這些藥物靶點(diǎn)的技術(shù)，但肯定不是最后用來(lái)決定藥物走向臨床試驗(yàn)的技術(shù)。任何臨床實(shí)驗(yàn)都需要大量的前期實(shí)驗(yàn)才能被FDA批準(zhǔn)，只靠RNAi 實(shí)驗(yàn)是不可能的。這里肯定有其他因素，不是RNAi 的結(jié)果就能全部解釋的。”
金鵬同時(shí)指出，癌細(xì)胞基因組出了名的不穩(wěn)定，因此作者使用的細(xì)胞系可能有一些問(wèn)題。 “這項(xiàng)研究所有的結(jié)論都來(lái)自體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（in vitro），他們應(yīng)該用活體細(xì)胞（ex vivo）來(lái)驗(yàn)證他們不同尋常的結(jié)論。”
“另外，作者認(rèn)為 CRISPR 技術(shù)可以產(chǎn)生背景更干凈，更好的敲除細(xì)胞系。但CRISPR 也存在脫靶和其它我們目前還未知的問(wèn)題。就像 RNAi 一樣，隨著時(shí)間的推移，人們也逐漸意識(shí)到 RNAi 不同的問(wèn)題，但至少它還是一個(gè)不錯(cuò)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。”
“時(shí)間會(huì)給出答案。” 金鵬說(shuō)。
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