外泌體是一種小型胞外囊泡（sEVs），來自于多泡體（MVBs），通過運輸?shù)鞍踪|(zhì)、mRNA和miRNA介導(dǎo)細(xì)胞間的通信。然而，哪類蛋白質(zhì)被歸為sEVs的分子機(jī)制還不是完全清楚。在這里，作者報道了泛素樣3（UBL3）膜錨定的Ub折疊蛋白MUB作為翻譯后修飾因子PTM調(diào)節(jié)蛋白向胞外囊泡轉(zhuǎn)化。作者發(fā)現(xiàn)UBL3的修飾對于將UBL3歸類到MVBs是不可缺少的。同時作者還發(fā)現(xiàn)從UBL3缺失型小鼠樣本中純化的sEVs總蛋白，與野生型小鼠相比減少60%，并從蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了1241個與UBL3互作蛋白，包括Ras。作者展示了UBL3改變Ras基因和致癌基因RasG12V突變體，UBL3的表達(dá)促進(jìn)RasG12V到sEVs的轉(zhuǎn)變。綜上所述，結(jié)果表明PTM被UBL3取代并影響蛋白到sEVs的歸類轉(zhuǎn)化。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. UBL3作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子的分析
目前對于UBL3作為PTM轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子的作用還不清楚，為了明確這一調(diào)控機(jī)制，作者在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)帶Flag的Flag-UBL3（16kDa），并通過免疫共沉淀純化UBL3蛋白。有趣的是，在過表達(dá)Flag-UBL3細(xì)胞中，UBL3條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，并在樣品裝入SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳之前添加2-mercaptoethano（βME+）后信號消失。為了驗證UBL3修飾確實發(fā)生在體內(nèi)，作者建立了UBL3敲除小鼠，并在腦組織（此組織UBL3高表達(dá)）中分析PTM，發(fā)現(xiàn)PTM表達(dá)下降。作者同時構(gòu)建了UBL3C113/114突變，檢測發(fā)現(xiàn)不僅在MDA-MB-231細(xì)胞中，在每一個所檢測的細(xì)胞中UBL3均不表達(dá)。但在UBL3C113A和UBL3C114A突變體中，UBL3修飾表達(dá)雖降低但仍能檢測到其表達(dá)。
2. UBL3向MVBs和sEVs轉(zhuǎn)化過程中UBL3的修飾不可缺少
作者通過免疫熒光檢測UBL3的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中UBL3修飾程度下降。接著構(gòu)建UBL3加EGFP熒光，并與MVBs的標(biāo)記物CD63進(jìn)行融合分析，進(jìn)一步驗證UBL3在MVBs多泡體中富集。為進(jìn)一步證明MVBs多泡體中UBL3修飾與定位，作者檢測了UBL3C113A、UBL3C114A、UBL3C113/114A及UBL3△1與CD63融合分析，與野生型UBL3檢測不同，野生型的未見到與CD63融合。為了了解UBL3在多泡體及膜中的定位，作者又進(jìn)一步安排了免疫電鏡檢測。將加了Flag標(biāo)簽的UBL3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞后，UBL3在MVBs及質(zhì)膜中表達(dá)清晰，在線粒體及核膜中未檢測到表達(dá)。其中UBL3△1主要定位于質(zhì)膜，不在MVBs中。這些結(jié)果顯示UBL3修飾在MVBs形成中是必須的。
3. UBL3敲除小鼠中外泌體中總蛋白下降，UBL3修飾影響蛋白向胞外分泌
作者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，MVBs更多的傾向于分泌成胞外囊泡EVs，將MDA-MB-231細(xì)胞分泌上清分別在2000×g（2K）離心力、10000×g（10K）離心力及100000×g（100K）離心力下離心，發(fā)現(xiàn)在100k離心力下UBL3富集程度。通過對構(gòu)建的UBL3敲除小鼠與正常小鼠進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，發(fā)現(xiàn)UBL3敲除小鼠中外泌體總蛋白含量比野生型降低60%。
為更好的了解UBL3修飾后其生理功能，作者進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析，UBL3互作蛋白依賴于兩個C端半胱氨酸殘基的方式。同時作者發(fā)現(xiàn)在與UBL3互作的蛋白中至少有22個與疾病相關(guān)的分子，包括與腫瘤形成、代謝、轉(zhuǎn)移等相關(guān)，例如HRAS、KRAS、TGFBR1、TGFBR2、RB1、ITGA6、ITGB4、mTOR、TSC2及APLP2。同時發(fā)現(xiàn)與免疫應(yīng)答相關(guān)的分子mTOR、RPTOR及TSC2，Notch信號分子NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3等。為檢測UBL3是否經(jīng)外泌體形式引起受體細(xì)胞中Ras信號激活，作者將從經(jīng)RasG12V轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞上清中提取的經(jīng)PKH67包被的外泌體與細(xì)胞共孵育，檢測磷酸化ERK的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于從UBL3C113/114A及RasG12V共轉(zhuǎn)染后提取外泌體孵育組，磷酸化的ERK（pERK）在經(jīng)野生型UBL3及RasG12V共轉(zhuǎn)染后外泌體孵育組pERK表達(dá)明顯上調(diào)。UBL3修飾誘導(dǎo)了RasG12V到外泌體sEVs轉(zhuǎn)化過程中Ras信號的激活，UBL3作為一個類似于標(biāo)簽的作用向sEVs傳遞蛋白。
文章小結(jié)
1.通過研究數(shù)據(jù)表明UBL3通過C端半胱氨酸殘基二硫鍵結(jié)合靶蛋白，盡管UBL3有泛激素類似的區(qū)域，但UBL3修飾與傳統(tǒng)泛激素作用不同。
2. 作者證明了UBL3修飾在UBL3向MVBs及sEVs轉(zhuǎn)化過程中起重要作用。檢測到1241個與UBL3C端半胱氨酸殘基互作蛋白，其中29%被注釋為胞外泌體，同時發(fā)現(xiàn)UBL3敲除小鼠中外泌體蛋白總量降低60%，顯示UBL3極大可能參與過半的外泌體蛋白歸類過程。UBL3與特定蛋白的結(jié)合是短暫的，只有UBL3修飾后蛋白在細(xì)胞裂解過程中穩(wěn)定存在。
3. 外泌體sEVs中的特異性蛋白在腫瘤的生長發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中其中重要的作用。本文中作者通過蛋白質(zhì)組學(xué)確定了1241個依賴于兩個C端半胱氨酸殘基結(jié)合與UBL3互作的蛋白，其中包括了至少22個疾病相關(guān)分子，影響pERK磷酸化蛋白的表達(dá)。因此，抑制UBL3修飾可能成為與Sev相關(guān)疾病的治療靶點，具有潛在的影響。
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