“It is very easy to answer many fundamental biological questions; you just look at the thing!”——1965年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)得主理查德•費(fèi)曼教授

      正如費(fèi)曼教授所言，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的核心正在于“看清事物”。只要分辨率足夠高，能看清諸多生物分子在原子層面上的細(xì)節(jié)，它們的工作方式也就不言自明了。也正是由于這個(gè)原因，從歷史上看，結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域做出的發(fā)現(xiàn)，帶來(lái)了許多生物學(xué)突破，也推動(dòng)了不少創(chuàng)新療法的開發(fā)。

      在諸多讓人類“高清看世界”的技術(shù)里，X射線晶體學(xué)是生物學(xué)家們使用最多的技術(shù)之一，也讓人類獲得了大量生物大分子的結(jié)構(gòu)。但這種方法需要事先獲取這種大分子的晶體。盡管許多蛋白質(zhì)和一些穩(wěn)定的復(fù)合體能產(chǎn)生質(zhì)量足夠高的晶體，但對(duì)于膜蛋白或動(dòng)態(tài)的復(fù)合體來(lái)說(shuō)，獲取晶體就不是那么容易。

      我們能不依賴于晶體獲取，直接“觀察”這些大分子嗎？自上世紀(jì)70年代起，許多先驅(qū)嘗試使用基于電子顯微鏡的方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。最初，它的分辨率并不盡如人意。但經(jīng)歷了40年的發(fā)展，冷凍電鏡技術(shù)取得了突破，一躍成為了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主流工具之一，與X射線晶體學(xué)形成了完美的互補(bǔ)。

      單粒子冷凍電鏡的誕生

      事實(shí)上，想通過(guò)電子顯微鏡來(lái)看清生物大分子，并不是一件容易的事。首先，和通常的照片一樣，電子顯微鏡獲取的圖像是二維的，而生物大分子的結(jié)構(gòu)是三維的。這一問(wèn)題通過(guò)一個(gè)巧妙的方法得到了解決：對(duì)于同一個(gè)生物大分子，我們可以從不同的角度獲取它的二維圖片。將這些圖片整合到一起，就可以重建出三維的結(jié)構(gòu)。

      而電子顯微鏡遇到的另一個(gè)問(wèn)題，曾一度被認(rèn)為是它的致命硬傷——為了達(dá)到效果，電子束必須處于真空環(huán)境之中。于是，這些樣本也必須位于同樣的真空里。對(duì)于生物大分子來(lái)說(shuō)，這就造成了嚴(yán)重問(wèn)題：真空導(dǎo)致的脫水會(huì)對(duì)樣本的結(jié)構(gòu)完整性帶來(lái)破壞性的影響。從機(jī)制上看，用電子顯微鏡來(lái)觀察生物大分子就好像是個(gè)不可能完成的任務(wù)。

      1974年發(fā)表在《科學(xué)》雜志上的一項(xiàng)研究彰顯了人類的智慧。在加州大學(xué)伯克利分校，還是在讀研究生的Kenneth Taylor與其導(dǎo)師Robert Glaeser教授表明，生物大分子的結(jié)構(gòu)完整性，可以通過(guò)將它們“凍起來(lái)”而得到保留。這一發(fā)現(xiàn)在上世紀(jì)80年代被Jacques Dubochet教授及其同事們發(fā)揚(yáng)光大，基于這一發(fā)現(xiàn)開發(fā)的樣本制備技術(shù)時(shí)至今日都沒有出現(xiàn)很大的改動(dòng)。

      研究人員們也指出了電子顯微鏡的第三個(gè)問(wèn)題——高能電子束帶來(lái)的輻射可能會(huì)對(duì)生物學(xué)樣本造成破壞，從而限制了電子束的強(qiáng)度。而電子束較弱的結(jié)果，便是過(guò)低的信噪比。Richard Henderson教授等人提出的一個(gè)解決方案，將晶體學(xué)中的技術(shù)應(yīng)用到電子顯微鏡成像過(guò)程中。利用電子晶體學(xué)（electron crystallography）技術(shù)，人們?nèi)〉昧艘幌盗羞M(jìn)展，解析出的結(jié)構(gòu)分辨率達(dá)1.9 Å。

      而Joachim Frank教授則希望能夠規(guī)避結(jié)晶這一手段來(lái)確認(rèn)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。他提出，通過(guò)對(duì)同一種蛋白粒子進(jìn)行大量的獨(dú)立拍攝，再通過(guò)計(jì)算機(jī)來(lái)整合這些圖片，有望能獲得高清的結(jié)構(gòu)。這一創(chuàng)新的想法與樣本的冷凍制備相結(jié)合，成為了如今我們熟悉的“單粒子冷凍電鏡”（single-particle cryo-EM）。Frank教授、Dubochet教授、以及Henderson教授三人也共享了2017年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

      結(jié)構(gòu)生物學(xué)的新紀(jì)元

      單粒子冷凍電鏡技術(shù)為結(jié)構(gòu)生物學(xué)帶來(lái)了新的突破，使其邁入了新紀(jì)元。原本難以結(jié)晶的目標(biāo)，其結(jié)構(gòu)也能展現(xiàn)在人類面前，膜蛋白就是這樣的例子。在這篇綜述中，加州大學(xué)舊金山分校的程亦凡教授介紹了冷凍電鏡如何協(xié)助我們獲得了瞬態(tài)受體電位（TRP）離子通道的結(jié)構(gòu)。

      TRP通道超家族分為7大類，在人類中總共有27個(gè)成員，每一個(gè)通道都有著特定的生理功能，其中一些也有望成為治療人類疾病的靶點(diǎn)。但除了這些通道里的少數(shù)小型結(jié)構(gòu)域外，人們對(duì)這些通道的結(jié)晶嘗試往往以失敗而告終，這也限制了對(duì)這些靶點(diǎn)的進(jìn)一步開發(fā)。

      2013年，這一困境迎來(lái)了終結(jié)。當(dāng)年，《自然》上的兩篇論文利用單粒子冷凍電鏡技術(shù)，獲取了TRPV1離子通道位于三種不同狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，讓我們更好地理解了其“感受熱量，激活疼痛通路”的作用。TRPV1結(jié)構(gòu)的獲得再次強(qiáng)調(diào)了冷凍電鏡的巨大潛力——當(dāng)“獲取晶體”這一限速步驟被移除后，我們能夠以極快的速度獲得膜蛋白的原子結(jié)構(gòu)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在不到5年的時(shí)間里，每一類TRP通道，均有至少1個(gè)成員的結(jié)構(gòu)得到了解析。

      對(duì)于大型的動(dòng)態(tài)復(fù)合體來(lái)說(shuō)，冷凍電鏡更是讓原本無(wú)法通過(guò)結(jié)晶獲取的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)在了人類面前，剪接體就是極佳的例子。過(guò)去，人們要么只能獲得其中片段的原子結(jié)構(gòu)，要么只能獲得分辨率較低的整體結(jié)構(gòu)。而在單粒子冷凍電鏡的協(xié)助下，在幾年里，我們就獲得了剪接體在不同工作狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，從而拼接出了它工作的完整畫面。這在過(guò)去是難以想象的。

      冷凍電鏡領(lǐng)域前所未有的發(fā)展速度，也吸引了諸多醫(yī)藥企業(yè)的關(guān)注。它們期望能夠應(yīng)用這一技術(shù)，優(yōu)化藥物的發(fā)現(xiàn)過(guò)程。

      醫(yī)藥企業(yè)的嘗試

      在去年11月的一篇《Nature Reviews Drug Discovery》綜述中，作者M(jìn)ark Peplow博士為我們盤點(diǎn)了藥企在冷凍電鏡領(lǐng)域的布局與嘗試。

      對(duì)于大型藥企來(lái)說(shuō)，在公司內(nèi)部的建立冷凍電鏡能力是其布局的主要方向——基因泰克在組建內(nèi)部的冷凍電鏡團(tuán)隊(duì)；輝瑞斥資500萬(wàn)英鎊使用新款的冷凍電鏡；諾華通過(guò)與Friedrich Miescher研究所的合作也構(gòu)建了自己的冷凍電鏡中心。諾華生物醫(yī)藥研究所（NIBR）的蛋白質(zhì)科學(xué)負(fù)責(zé)人Christian Wiesmann說(shuō)，他們的冷凍電鏡中心已經(jīng)初見成效。利用冷凍電鏡技術(shù)，他們獲得了一款蛋白與一種小分子結(jié)合時(shí)的結(jié)構(gòu)，這能指導(dǎo)藥物化學(xué)的開發(fā)。

      對(duì)于另一些藥企或生物技術(shù)公司來(lái)說(shuō)，他們決定組成聯(lián)盟，共同使用冷凍電鏡工具。這一方面是出于成本的考量，但更重要的是，這種聯(lián)盟能夠促進(jìn)經(jīng)驗(yàn)的交流。在英國(guó)，劍橋醫(yī)藥冷凍電鏡聯(lián)盟（Cambridge Pharmaceutical Cryo-EM Consortium）就是這樣的例子——在5家藥企的合作下，這一聯(lián)盟獲得了超過(guò)300萬(wàn)英鎊的資金，于2016年正式啟動(dòng)。

      去年5月，該聯(lián)盟的成員之一阿斯利康發(fā)表了一篇論文，揭示了人類突變ATM蛋白的結(jié)構(gòu)。ATM蛋白是一類大型激酶，與DNA的修復(fù)有關(guān)，在癌癥發(fā)病中有潛在的作用。而研究人員們獲得的結(jié)構(gòu)，其分辨率為4.4Å，足以看清其兩個(gè)構(gòu)象，其中一個(gè)處于“打開”狀態(tài)，可以結(jié)合底物；另一個(gè)則處于“關(guān)閉”狀態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)帶來(lái)了該蛋白的首個(gè)高清結(jié)構(gòu)，也表明它作為分子開關(guān)的重要作用。

      該聯(lián)盟的另一個(gè)成員Heptares則在探索GPCR的結(jié)構(gòu)。作為一類膜蛋白，它們通常會(huì)因?yàn)榉蛛x過(guò)程而失去正常的結(jié)構(gòu)與活性，因此難以通過(guò)常規(guī)的結(jié)晶手段制備樣本。但冷凍電鏡技術(shù)則沒有這樣的困擾。目前，我們獲得的GPCR結(jié)構(gòu)已能讓我們看清它們與大型多肽相結(jié)合時(shí)的結(jié)構(gòu)。它們與小分子結(jié)合時(shí)的高清結(jié)構(gòu)，會(huì)是研究人員們未來(lái)的研究方向。

      冷凍電鏡的未來(lái)

      冷凍電鏡領(lǐng)域在過(guò)去40年里發(fā)生了重大的改變，而這一技術(shù)還有不少可以提高的空間。其中的一大關(guān)鍵在于進(jìn)一步提高分辨率，達(dá)到2Å左右，另一大關(guān)鍵在于提高使用的效率。如果我們能夠快速獲得大批樣品的高清結(jié)構(gòu)，無(wú)疑將加速這項(xiàng)革命性技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

      此外，硬件與軟件的升級(jí)，也將提升冷凍電鏡的能力。更好的光學(xué)系統(tǒng)、更好的檢測(cè)器、更好的算法軟件，都能讓冷凍電鏡在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上如虎添翼。正如一些業(yè)內(nèi)資深人士指出的那樣，要實(shí)現(xiàn)這樣的功能迭代，讓冷凍電鏡成為新藥發(fā)現(xiàn)的常規(guī)工具，或許還需要5到10年的時(shí)間。但對(duì)于諸多醫(yī)藥與生物技術(shù)公司而言，目前或許是將這一工具整合至研發(fā)系統(tǒng)中的時(shí)機(jī)。