近日，一篇討論腫瘤免疫療法的文章引起了許多行業(yè)人士的關注。這篇文章發(fā)表于“腫瘤免疫療法研究趨勢”網(wǎng)站，作者是楊森制藥（Janssen Pharmaceutical Companies）的腫瘤免疫學家Nataša Obermajer博士。在這篇文章里，作者深度討論了兩類使T細胞靶向腫瘤的方法——嵌合抗原受體（CAR）與雙特異性抗體（BsAb）。在今天的報道里，藥明康德微信團隊也將為各位讀者整理這篇文章的核心內(nèi)容。

       前言

       在最新一代的腫瘤免疫療法中，科學家們將目光投向了T細胞。利用這些細胞的腫瘤殺傷能力，我們有望設計出全新的抗癌療法。在過去的幾年里，CAR-T細胞療法與雙特異性抗體療法使T細胞能有效地靶向CD19等抗原，為罹患B細胞惡性癌癥的患者帶來了極好的緩解，也為腫瘤免疫療法領域帶來了革新。

       盡管這些創(chuàng)新療法帶來了積極的臨床效果，但它們面臨著類似的問題：在血液癌癥中，它們有潛在的**風險。而在實體瘤的治療上，它們的療效還尚未得到證實。為此，我們有必要了解這些療法背后的機理與局限，以及它們在未來的應用潛力。

       嵌合抗原受體（CAR）

       CAR是指一類人工合成的受體，它包括了細胞外的腫瘤抗原識別區(qū)域，以及一個用于細胞內(nèi)信號通路的CD3ζ區(qū)域。此外，CAR抗體還會包括1到2個共刺激域。當其單鏈可變片段（scFv）與腫瘤發(fā)生結(jié)合后，能激活T細胞受體，從而導致T細胞對表達抗原的細胞產(chǎn)生反應。

       去年，美國FDA批準了兩款CAR-T療法上市，它們分別是諾華的Kymriah （tisagenlecleucel）與Kite Pharma（已被吉利德收購）的Yescarta（axicabtagene ciloleucel）。這兩款CAR-T療法都靶向致癌性B細胞表面的CD19抗原：前者治療B細胞急性淋巴性白血病，能取得高達83%的緩解率；后者則在B細胞非霍奇金淋巴瘤的治療中，取得了72%的緩解率。

       在這兩款療法之外，還有不少CAR-T療法正在開發(fā)之中，它們來自Juno Therapeutics，Celgene，bluebird bio，Mustang Bio，Servier，Pfizer，Cellectis，以及Celyad等生物醫(yī)藥公司。不同研發(fā)人員開發(fā)的CAR-T療法，其CAR結(jié)構(gòu)可以很多樣化，細胞外結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域，以及細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域都能有所區(qū)別。

       最近，一些新藥研發(fā)人員也正在設計全新的CAR。其中一些CAR-T細胞能特異性靶向腫瘤微環(huán)境，以克服腫瘤的免疫抑制效果。舉例來說，IL4R細胞外結(jié)構(gòu)域與IL7R細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的融合，可以靶向細胞因子，從而讓T細胞在抑制性細胞因子IL4存在的情況下，依然可以得到激活和增殖；此外，表達趨化因子受體CCR2b的CAR-T細胞也能靶向腫瘤表面高度表達的CCL2；一些CAR能靶向腫瘤血管上過量表達的VEGFR2或αvβ3，增強CAR-T細胞對腫瘤的穿透能力；還有一些新穎的療法可以將CAR-T細胞作為特定細胞因子或共刺激因子的遞送者，增強內(nèi)源效應T細胞的浸潤。

       雙特異性抗體（BsAb）

       在CAR之外，另一個使用單鏈可變片段（scFv）技術的新領域是雙特異性抗體。在上世紀80年代中期，人們造出了首個能將T細胞導向特定抗原的雙特異性抗體。自那以后，雙特異性抗體領域取得了快速的發(fā)展。到2017年，這一領域的論文總數(shù)已經(jīng)超過了2500篇。目前，絕大部分的雙特異性抗體是通過DNA重組技術來生成的，而通過化學方法將兩個單克隆抗體進行交聯(lián)的技術也在一些研究中證明了其可行性。在這一領域的蓬勃發(fā)展下，大量雙特異性抗體正在臨床前和臨床試驗中驗證它們的潛力。通過將T細胞直接引導至靶向細胞，這些T細胞的激活將不受MHC的限制，也不需要依賴于天然T細胞受體的特異性。

       雙特異性抗體的構(gòu)型有許多種。一些研究表明，針對某些特定的抗原，某種構(gòu)型可能表現(xiàn)更佳。但通常意義上說，一種結(jié)構(gòu)是不足以滿足所有需求的。這是因為單克隆抗體的互動、抗原上的表位位置、以及抗原在靶向細胞表面的密度與運動性，都會影響到T細胞的激活。

       在諸多雙特異性抗體中，許多研究人員對雙特異性T細胞接頭（BiTEs）有獨特的興趣。這是一類重組的雙特異性蛋白，具有兩個相連的單鏈可變片段，其中一個靶向T細胞表面的分子（如CD3ε），另一個靶向癌細胞表面的抗原。這兩種單鏈可變片段被靈活地連接在一起。

       2014年，美國FDA批準了能夠針對CD19的BiTE分子Blincyto®（blinatumomab），用于費城染色體陰性的復發(fā)或難治性B細胞前體急性淋巴性白血?。ˋLL）的治療。Blinatumomab由VL-VH向的抗CD19單鏈可變片段，與VH-VL向的抗CD3單鏈可變片段，通過G4S連接。由于分子體積較小，這些BiTE的半衰期只有1.25小時。為了克服這一限制，人們正在研究一些新的方法，譬如將BiTE連接到重鏈片段，或是做出其他新的設計，以提高它在血清里的半衰期。此外，它也能通過連續(xù)的輸注治療，確保體內(nèi)的濃度。

       最近，行業(yè)對BiTE的體內(nèi)制造產(chǎn)生了興趣。其一大策略是通過基因改造的T細胞來產(chǎn)生BiTE，這能克服其半衰期較短的問題。另一種方法是使用溶瘤病毒來表達BiTE。與此同時，研究人員們也指出了BiTE的一大挑戰(zhàn)：它的活性取決于腫瘤部位的T細胞種類和密度。倘若這些T細胞都已經(jīng)耗竭，或都是調(diào)節(jié)性T細胞，就會影響到BiTE的效果。

       另一種雙特異性抗體——雙鏈抗體（diabody）是由兩條鏈組成的雙價分子，每一條鏈都具有VH和VL結(jié)構(gòu)域。在雙鏈抗體中，兩個可變結(jié)構(gòu)域通過較短的連接子（如G4S）相連。也正是由于這些連接序列較短，雙鏈抗體無法通過鏈內(nèi)重組形成抗原結(jié)合位點。相反，這兩條鏈會以“頭-尾”的方向形成雙聚體，成為一個緊實的分子。如果在同一個細胞內(nèi)同時表達這兩條鏈，就有望產(chǎn)生雙特異性的異體雙聚體，帶來相應的可變域（VHA-VLB / VHB-VLA，或VLA-VHB / VLB-VHA）。但此類雙鏈抗體的一個潛在問題在于，如果形成同源雙聚體，則無法帶來正確的可變域（VHA / VLB或VHB / VLA）。一個替代做法是在這兩條鏈的C端上，將半胱氨酸共價鏈接，即雙親性重靶向蛋白（dual-affinity retargeting proteins, DART）。

       作用機制中的關鍵

       T細胞的亞群：在CAR-T細胞療法中，CD4陽性和CD8陽性的T細胞經(jīng)常被混在一起進行基因編輯，插入CAR，再被輸注回患者體內(nèi)。盡管CD8陽性的T細胞被認為是殺傷癌細胞的主力軍，但CD4陽性的T細胞在裝備了CAR之后，同樣能被激活，并顯示出細胞裂解的活性。同樣，在與BiTE分子共同培育時，CD8和CD4陽性的T細胞也都能被激活，誘導靶向腫瘤細胞的死亡。其中的區(qū)別在于CD8陽性的T細胞殺傷速度更快。

       T細胞的表型：現(xiàn)在我們知道，分化水平越低的CAR-T細胞，在體內(nèi)的療效越好。因此，研究人員們期望能盡量產(chǎn)生TSCM（stem memory T cell）與TCM（central memory T cell），并對其保持維持。但在BiTE領域，我們需要不同的T細胞類型。初始T細胞在BiTE的作用下，無法被激活。因此， BiTE介導的細胞**，需要和共刺激信號通路無關的T細胞群體參與。

       連接的結(jié)構(gòu)域：由BiTE與CAR介導的T細胞-靶向細胞的結(jié)合在形式上有所不同。這可能是因為BiTE涉及到了天然的CD3復合體。對于BiTE來說，腫瘤相關抗原表位與靶向細胞膜之間的距離，決定了它的活性。這可能是不同雙特異性抗體療效產(chǎn)生差異的原因。

       T細胞的擴增：CAR-T細胞在擴增后，可達到體內(nèi)循環(huán)淋巴細胞的20%之多。而對于BiTE來說，大量曾接觸過抗原的T細胞能直接加以利用，從而減少了對于細胞擴增的依賴。相比CAR-T細胞動輒擴增1000倍以上，在一些BiTE案例中，T細胞只需擴增2-4倍。這一特性有望讓BiTE在實體腫瘤的治療上更具優(yōu)勢。當然，這需要建立在對實體瘤進行良好穿透的前提下。

       親和性：最初，人們認為較低的CD3親和性（KD ～ 10 ^ -7M或以上）能避免非特異性的T細胞激活。這是因為高親和性（KD ～ 10 ^ -9M - 10 ^ -8M或以下）的二價CD3結(jié)合可能會帶來非靶向特異的T細胞激活。但后續(xù)的研究則表明這些非特異的激活可能與抗體的交聯(lián)有關，而非二價結(jié)合的直接后果。

       T細胞療法的未來

       作者在文章中指出，在T細胞療法領域，未來主要的幾大策略包括：

       通過提供積極的刺激，或是對免疫檢查點進行抑制，增強臨床上的抗腫瘤效果

       尋找到創(chuàng)新的靶點，以克服實體腫瘤微環(huán)境導致的耐受，或是克服惡性血液癌癥中由于抗原表達下調(diào)而導致的獲得性耐受

       尋找到T細胞的新來源，如異體的通用型T細胞療法

       精準地調(diào)控效應細胞，以限制療法的**

       先進的CAR工程化技術有望能拓展CAR的結(jié)合能力，讓其靶向多種不同的抗原。如果CAR-T細胞能結(jié)合兩種抗原，并只有在同時結(jié)合的情況下才被激活，則有望為這一療法帶來革新。作者指出，這些細胞能先通過第一代CAR技術結(jié)合第一種抗原，產(chǎn)生第一個信號。接著，通過設計一款嵌合的共刺激CAR（只在沒有CD3ζ的情況下發(fā)生共刺激），第二款抗原能產(chǎn)生第二個信號。在實體瘤領域，類似的腫瘤相關抗原的“雙靶向”策略有望增強T細胞的選擇性，拓展應用前景。為了確保這種方法能取得成功，我們必須對腫瘤相關抗原進行仔細的選擇，確保它們在細胞表面存在或表達。

       最近的一些新型CAR設計保留了CAR的骨架，但使用了單鏈可變片段之外的結(jié)構(gòu)域。比如有些公司使用的是CD16的細胞外結(jié)構(gòu)域，一些公司開發(fā)的T細胞表達有自然殺手細胞的受體（NKG2D），以靶向8種不同的腫瘤配體。

       另一些公司正在嘗試使用不同的T細胞。比如bluebird bio和蘇格蘭的生物技術公司TC Biopharm合作，利用gamma delta T細胞，開發(fā)針對實體瘤的CAR-T療法。按設想，這種療法能選擇性地靶向癌細胞，而不會攻擊健康細胞，從而顯著降低**。

       還有一類新穎的設計是使用藥物分子去激活CAR。在這類設計中，CAR的信號元件被分成了幾大塊。只有在某種藥物存在的前提下，它們才會聚集在一起產(chǎn)生信號。由Cellectis授權給Servier與輝瑞（Pfizer）的UCART19就具有類似的開關。只有在rapamycin存在的情況下，CAR-T才會被激活。Bellicum Pharmaceuticals的GoCAR-T療法同樣應用了類似的技術，激活它的藥物是rimiducid。

       在對T細胞的激活進行調(diào)控之外，行業(yè)里的另一個熱點是開發(fā)終止CAR-T細胞功能的開關，以限制其短期或長期的**。這一般要求在CAR的設計中插入“自殺基因”，以在特殊藥物分子的作用下，特異性地摧毀這些細胞，控制副作用。其中，一些裝有自殺基因的T細胞療法已經(jīng)進入了臨床試驗階段，其中一類表達有HSV-TK，一類表達有iCASP9。前者能被ganciclovir激活，“自殺”效果較好，但其免疫原性可能會限制其應用（因為它來自于皰疹病毒的胸苷激酶）；后者則是將突變的FKBP12與caspase 9的催化結(jié)構(gòu)域相融合，它的免疫原性較好。

       后記

       在本文的最后，作者指出CAR-T細胞療法與雙特異性抗體在不同的臨床試驗中，各自有其表現(xiàn)出眾的地方。值得一提的是，這兩種療法在作用機制上各有千秋，如果患者無法從一種療法上得到緩解，不代表他們無法從另一種療法上受益。事實上，有兩名患者在接受了blinatumomab的治療后病情復發(fā)，但卻在靶向同一抗原的CAR-T療法治療后達到完全緩解。未來，我們需要更加深入地了解兩類療法的優(yōu)勢，并考慮組合使用的可能。

       參考資料：

       [1] Bridging T cells to Tumors: CARs vs BsAb. Retrieved August 9, 2018 from https://www.immuno-oncologyresearchtrends.com/home/2018/7/21/cancer-re-direction-and-t-cell-therapies-cars-vs-bites-or-tcr-and-immtacs

       [2] Zhukovsky et al., (2016) Bispecific antibodies and CARs: generalized immunotherapeutics harnessing T cell redirection, Current Opinion in Immunology, https://doi.org/10.1016/j.coi.2016.02.006

       [3] Velasquez et al., (2018) Redirecting T cells to hematological malignancies with bispecific antibodies

       原標題：深度長文：T細胞療法的這些細節(jié)，你全都知道嗎？