乳酸和銨是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不可避免的兩種代謝副產(chǎn)物，兩者的累積都是不想看到的，因?yàn)檫@兩種代謝副產(chǎn)物積累會(huì)影響到細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量等。文中筆者對(duì)乳酸和銨影響細(xì)胞生長(zhǎng)的緣由，以及如何降低兩者的細(xì)胞**進(jìn)行了簡(jiǎn)要概述。
乳酸
CHO細(xì)胞培養(yǎng)前期往往有少量的乳酸積累，特別是在細(xì)胞代謝旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，一般情況下細(xì)胞都可以將這些乳酸代謝消耗掉。但有時(shí)這對(duì)于某些細(xì)胞株并不順利，乳酸的累積對(duì)細(xì)胞是致命的。乳酸主要來(lái)源于葡萄糖的不完全氧化，乳酸的累積會(huì)使體系pH降低，為使pH回升添加的堿液往往會(huì)增加體系的滲透壓，從而影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝。而如果不加堿液調(diào)節(jié)pH，低pH環(huán)境對(duì)于細(xì)胞體內(nèi)的酶不是個(gè)好消息，酶活的降低會(huì)限制細(xì)胞代謝，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
為解除乳酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白產(chǎn)量的影響，可以考慮構(gòu)建對(duì)環(huán)境壓力耐受性高的細(xì)胞株，也可對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)策略進(jìn)行優(yōu)化。用代謝緩慢的糖類代替葡萄糖作為碳源可以降低乳酸的累積，如半乳糖、巖藻糖和麥芽糖的使用。而當(dāng)乳酸有一定累積時(shí)，可以通過(guò)葡萄糖的濃度來(lái)改變細(xì)胞的代謝路徑，改葡萄糖代謝為乳酸代謝，從而減少乳酸累積，但低糖消耗乳酸的策略對(duì)蛋白質(zhì)量的影響并不明確。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因改造也可以降低乳酸累積，如刪除乳酸脫氫酶（LDH）基因、擴(kuò)增丙酮酸羧化酶（PYC2）基因等。其中LDH是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶，PYC2是參與將乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油轉(zhuǎn)化生成葡萄糖的催化酶，對(duì)兩者的基因改造可在代謝通路減少乳酸累積。
上述的方法雖然可降低乳酸累積，但操作性不強(qiáng)。筆者認(rèn)為，銅離子（Gu2+）的添加是目前為止降低乳酸累積的方法，除去Gu2+抑制乳酸累積的作用，許多研究中都提到Gu2+對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。Luo等就研究了不同濃度的Gu2+對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、乳酸累積和蛋白產(chǎn)量的影響，如圖1所示，培養(yǎng)至第五天時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)開(kāi)始出現(xiàn)差異，高濃度Gu2+實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度繼續(xù)增加、乳酸開(kāi)始消耗；而低濃度Gu2+實(shí)驗(yàn)組的乳酸一直在累積，開(kāi)始顯現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的抑制作用；從蛋白產(chǎn)量看，高濃度Gu2+實(shí)驗(yàn)組的蛋白濃度要高些，可知Gu2+的添加可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)乳酸的消耗及細(xì)胞生長(zhǎng)。值得注意的是，Gu2+的添加會(huì)影響到單抗的質(zhì)量，如增加堿性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。
圖1 Gu2+濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、乳酸累積及蛋白產(chǎn)量的影響
（圖片來(lái)源于參考文獻(xiàn)1）
銨
作為細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的另一代謝副產(chǎn)物，銨受到的關(guān)注遠(yuǎn)沒(méi)有乳酸多，這是因?yàn)槟壳笆褂玫腃HO細(xì)胞中多采用的谷氨酰胺合成酶（GS）擴(kuò)增系統(tǒng)，而GS細(xì)胞一般都可以利用銨來(lái)合成谷氨酰胺，因此關(guān)于降低銨累積對(duì)細(xì)胞**作用的研究較少。然而并不是所有的細(xì)胞系都是GS系統(tǒng)，還有二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase，DHFR）篩選系統(tǒng)等，因此對(duì)銨的**機(jī)理、降低累積的認(rèn)識(shí)還是很有必要的，可以幫助我們更好的理解細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程。
體系中的銨主要來(lái)自于谷氨酰胺等的代謝降解和自發(fā)降解，其中自發(fā)降解只占很少一部分，大部分的銨都來(lái)自氨基酸如谷氨酰胺的代謝降解。正常情況下，培養(yǎng)體系中、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和線粒體的內(nèi)銨（NH4+）和氨（NH3）是處于一種動(dòng)態(tài)平衡下的，一定的pH時(shí)兩者維持一定的濃度，同樣兩者的平衡也是維持細(xì)胞胞內(nèi)pH穩(wěn)定的重要條件。而當(dāng)其中之一，如NH4+的濃度超出正常范圍時(shí)，平衡被打破，進(jìn)而引起胞內(nèi)pH的變化，影響細(xì)胞代謝相關(guān)酶的活性，不利于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)與代謝。還有學(xué)者認(rèn)為，由于銨本身就參與部分酶促反應(yīng)，如谷氨酸和銨合成谷氨酰胺的反應(yīng)、谷氨酸的進(jìn)一步降解等，銨濃度的改變也會(huì)對(duì)此類代謝產(chǎn)生不可預(yù)估的影響。
由此可知，銨的累積會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)pH失衡及酶活降低，進(jìn)而影響細(xì)胞表現(xiàn)。此外，銨的累積還會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)量造成影響，主要表現(xiàn)在降低糖鏈末端的唾液酸化水平。高濃度銨水平下，α(2,3)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶和GMP-唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水平都有一定降低，這不僅會(huì)導(dǎo)致胞液中唾液酸向高爾基體的轉(zhuǎn)動(dòng)量降低，還會(huì)影響糖鏈上的唾液酸連接，最終降低蛋白的唾液酸化。
根據(jù)銨的來(lái)源來(lái)降低是重要的策略，如采用不易自發(fā)降解的谷氨酰胺衍生物代替谷氨酰胺，以及使用谷氨酸代替谷氨酰胺添加到培養(yǎng)基中都是可以的方法。還有學(xué)者以氨基酸為出發(fā)點(diǎn)，研究了不同氨基酸對(duì)降低銨對(duì)細(xì)胞**的影響，最終得出蘇氨酸（threonine）、脯氨酸（proline）和甘氨酸（glycine）可以抑制高濃度銨對(duì)細(xì)胞的**。如圖2所示，同樣高濃度NH4Cl的情況下，添加以上三種氨基酸實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞要高些。基因手段也可以降低銨的累積，例如刪除乳酸脫氫酶（LDH）基因，有學(xué)者進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)LDH基因刪除的實(shí)驗(yàn)組，其乳酸及銨累積均有一定的降低。另外，合理的谷氨酰胺和葡萄糖補(bǔ)料策略也是控制銨濃度的方法之一。
圖2 氨基酸對(duì)高濃度銨離子添加培養(yǎng)基中細(xì)胞密度的影響
（圖片來(lái)源于參考文獻(xiàn)2）
參考文獻(xiàn)：
1. Comparative Metabolite Analysis to Understand Lactate Metabolism Shift in Chinese Hamster Ovary Cell Culture Process；
2. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells。
作者簡(jiǎn)介：知行，生物化工碩士，從事細(xì)胞培養(yǎng)方面的研究。工作之余密切關(guān)注國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥行業(yè)動(dòng)態(tài)以及研究進(jìn)展，用簡(jiǎn)單的語(yǔ)言講述不簡(jiǎn)單的未來(lái)，一個(gè)不斷前行的醫(yī)藥人。
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